ACGCATCGCCAA-3 '），以盐芥叶片cDNA为模板，进行基因克隆，得到完整ThPHT 1 -1基因 全长为1690bp，为本发明中所述盐芥耐低磷基因，见图1JCR克隆产物连接进pJETl. 2并测 序，与数据库中ThPHTl-lCDS(全长1566bp)比对，发现在CDS序列的403bp和404bp之间多了 124bp，ThPHTl-l基因如SEQ ID N0.1所示，重提盐芥叶片总RNA，并用DNasel处理后克隆，克 隆序列仍为1690bp。
[0045] 实施例2
[0046] 含盐芥耐低磷基因的重组载体pCAMBIA3301_ThPHTl-l的构建
[0047] 构建含有本发明的盐芥耐低磷基因的中间载体pJET1.2_ThPHTl-l、pD0NR201_ ThPHTl-1 和植物表达载体 pCAMBIA3301_ThPHTl-l，见图 2。
[0048]将胶回收纯化后的目的片段，纯化后的盐芥耐低磷基因（ThPHTl-Ι基因），利用 CloneJET PCR Cloning Kit(Clone JET PCR Cloning Kit#K123120rxns，Thermo)进行 pJET1.2_ThPHTl-l克隆载体的构建，并转化DH5a感受态细胞。
[0049] 利用目的片段的上下游引物PHT-F(SEQIDN0.2)和PHT-R(SEQIDN0.3)对菌落 进行PCR筛选，阳性菌送测序。提取测序正确菌液的质粒进行BP反应，筛选出阳性克隆 (pD0NR201_ThPHTl-l)，进行测序。
[0050] 同时，提取测序正确的BP菌质粒进行LR反应，筛选出阳性克隆，将筛选出的阳性克 隆扩大培养，提取质粒，转化C58感受态细胞。即盐芥耐低磷基因的植物表达载体 pCAMBIA3301_ThPHTl-l 的构建。
[0051 ] 实施例3
[0052]盐芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι在提高植物耐低磷性能方面的应用 [0053] 利用实施例2筛选的pCAMBIA3301_ThPHTl-l阳性表达载体(盐芥耐低磷基因的重 组载体)利用电击法转化农杆菌C58感受态细胞，C58感受态细胞具有利福平抗性(Rif)，辅 助质粒具有庆大霉素抗性(Gen)。
[0054] 将pCAMBIA3301_ThPHTl-l转化C58后，挑选单菌落，用克隆引物进行菌落PCR，如图 3所示，用1%的胶电泳，点样为5yL 2Xloading buffer+5yL PCR产物。条带大小为1690bp。 最左侧条带为Marker DL200(LPCR鉴定为阳性的菌落用以侵染拟南芥。
[0055] 农杆菌的活化与扩大培养:挑保存的阳性农杆菌的单菌落置于3mL含相应抗生素 的YEB液体培养基中Gen(25μg/ml) ;Rif (10μg/ml);草丁膦(50μg/ml)过夜培养15小时左右 (至OD600 = 0.8左右），170rpm，28°C。农杆菌的扩大培养:新鲜的10ml的YEB液体培养基中加 入适量的抗生素(Gen抗生素，浓度为25μg/ml;Rif抗生素，浓度为10μg/ml ;草丁膦抗生素， 浓度为SOμg/ml)，然后接种3ml上述所得农杆菌菌液，于50ml新鲜YEB液体培养基中进行培 养，170rpm，在28°C培养至0D 6QQ = 0.6。经培养得到含有一定数量重组载体的宿主细胞。
[0056] 经过上述步骤筛选的阳性农杆菌(含有重组载体的宿主细胞)进行保存，挑保存的 阳性农杆菌的单菌落过夜培养(至0D6Q() = 0.8左右），菌液离心后弃上清，用5%的蔗糖液体 重悬菌体后浸泡待转化的拟南芥的整个花序约30-45秒，取出拟南芥，使其横躺在托盘中， 用塑料薄膜罩住保湿，并暗处理12h，然后在温度25°C，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度： 70%的培养条件下下使其正常生长，直到种子成熟。种子采集后放到37°C烘箱烘干两周，已 备后续试验使用。
[0057]将收取的T1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4°C春化三天，然后在超净台上将已 经春化好的拟南芥种子均匀播种在含有50μg/ml草丁膦的1/2MS固体筛选培养基上，在22_ 25°C，140ymol/(m 2 · s)当转化植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤中，约一个半月后收 集种子即为T2代转化种子。采用相同方法进行筛选，继续生长一代后得到T3代种子，通过在 含草丁膦抗生素的1/2MS培养基上筛选，100%成活率的从种子即为T3代纯合体种子。
[0058]盐芥耐低磷基因转化拟南芥后，T3纯合体PCR测定表达水平结果，用克隆引物做半 定量，检测基因的表达情况，部分结果如图4所示。选取表达水平高的2个独立转化株系和野 生型拟南芥(WT)的种子同时无菌处理，平铺到MS固体平板上，4°C春化两天，22°C光照培养 箱萌发5天，然后移到低磷(50μΜ Pi)培养基上垂直培养5天，观察其表型差异。如图5所示， 在正常磷处理条件下，转盐芥耐低磷基因拟南芥(ThPHTl-Ι)和野生型对照基本一致;如图6 (ABC)所示，在低磷处理条件下，野生型和转盐芥耐低磷基因拟南芥在植株鲜重、根长和根 密度上有显著差异。
[0059]上述实验验证本发明的盐芥耐低磷基因具有耐低磷性能。
[0060]以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况 下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均 落入本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种盐芥耐低磷基因ThPHTl-1，其特征是所述基因是序列表中SEQIDN0.1所示的 核苷酸序列。2. 含权利要求1 一种盐芥耐低磷基因ThPHTl-Ι的重组载体。3. 含权利要求2所述重组载体的宿主细胞。4. 权利要求1 一种盐芥耐低磷基因ThPHTl-Ι在提高植物耐低磷性能的应用。
【专利摘要】本发明公开了盐芥耐低磷基因ThPHT1-1及重组载体及应用，盐芥耐低磷基因ThPHT1-1，是序列表中SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列；并公开了含上述基因的重组载体、含上述重组载体的宿主细胞；以及盐芥耐低磷基因ThPHT1-1在提高植物耐低磷性能的应用。采用本发明的盐芥耐低磷基因ThPHT1-1转染拟南芥表现出对低磷胁迫的耐受力，说明本发明提供的盐芥耐低磷基因ThPHT1-1在改良作物耐低磷的能力方面，起着重要的作用。
【IPC分类】C12N15/29, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105441458
【申请号】CN201510958374
【发明人】宋英今, 寇莹莹, 杨少辉, 王洁华
【申请人】天津大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月18日