定管加丙酮-0.1N盐酸-水(35:12:56)的混合液于具塞三 角瓶中稀释成l〇〇〇u/mL溶液，超声30分钟。用1N盐酸试液调节PH为2.8~3.2，过滤，再吸取 过滤液2mL置50mL容量瓶中，加 PH7.8缓冲液稀释至刻度，混匀，即为40u/mL的低稀释度(高 浓度）样品溶液；吸取适量（高浓度）样品溶液，用PH7.8缓冲液定量稀释4倍，得到浓度为 1 Ou/mL的高稀释度(低浓度)样品溶液。（40u/mL、1 Ou/mL，剂间比为4:1)这就是供试溶液。
[0053] D、按前面方法制备好平板，把钢圈放置在平板上，每个平板均一地放置4个钢圈。 [0054] E、点样:每份取8张平板，往平板上相对的2个钢圈中注入对照品稀释液(40u/mL、 10u/mL)，其它2个钢圈中注入供试溶液(40u/mL、10u/mL)。
[0055] F、培养:在36 ± 1°C的隔水式电热恒温培养箱里培养16-18小时。
[0056] G、培养结束后，从培养箱里取出平板，拆下钢圈。（小心地拆下不要破坏琼脂培养 基）
[0057] H、测量:用抑菌圈自动测量仪测量平板抑菌圈的直径，精确到0.01mm，对效价测定 结果进行精密度分析。
[0058] 检定培养基的组分以及用相应的检定培养基检测的结果如下：
[0059] 培养基 1-1:
[0060] 每lOOOmL培养基的组成
[0064] 培养基 1-2:
[0065] 每1000mL培养基的组成
[0068] 测试结果：
[0069]
[0070]培养基 1-3:
[0071] 每l〇〇〇mL培养基的组成
[0073]测试结果：
[0074]
[0076] 培养基 1-4:
[0077] 每l〇〇〇mL培养基的组成
[0079]~测试结果:
[0081] 培养基 1-5:
[0082] 每1000mL培养基的组成
[0084] 测试结果：
[0085]
[0086]从实验结果可以看到，5组培养基回归非常显著（P<0.01)，偏离平行不显著(P> 0.05 )，5组培养基实验都成立。但是第三组培养基1-3的平均可信限率Pt的FL%值最低，为 平均可信限率Pt的FL% = 1.98%，其他四组的平均可信限率Pt的FL%值均不低于3.0%，因 此第三组培养基1-3的成分配方比较好。
[0087] 实施例3
[0088]按照实施例1的步骤1和2准备实验。准备完成后，按照下列步骤绘制标准曲线： [0089 ] A、标准品溶液的配制（1000ug/mL)
[0090] 精确称取恩拉霉素标准品0.02546g于100mL三角瓶中，对照品效价为1090yg/mg。
[0091] 计算：称取标准品重量0 · 02546g X 1090yg/mg X 1000/1000yg/mL = 27 · 75mL(加 80 %甲醇溶液量）。用50mL滴定管把27.75mL 80 %甲醇溶液轻轻地放进三角瓶中，溶解后成 1000yg/mL 标准液。
[0092] B、经试验确定直线中心点的抗生素浓度为:20u/ml，中心点浓度使所致抑菌圈的 直径在16~17mm之间。
[0093] C、线性测定的剂距用等比级数，采用的等比级数为1:0.80。
[0094] D、每个浓度组为一组，设9组，每组3个双碟。
[0095] 浓度组以中心点浓度20u/ml为中心，按等比级数为0.8计算各浓度组为：
[0096]
[0097] E、分别从1000yg/mL标准液中吸取1-9组各浓度的标准液于25ml容量瓶中，吸取量 依次为：0.2048ml、0· 256ml、0· 32ml、0.4ml、0.5ml、0· 625ml、0· 78125ml、0· 97625ml、 1.22075ml，加 pH7.8缓冲液到25ml容量瓶至刻度。
[0098] F、取制备好底层及菌层培养基的双碟，每3个双碟为一组浓度组，共分9组，每一个 双碟中滴加相同浓度的标准液4点，各组滴加完毕后，将双碟在规定的36°C±1°C培养16~ 18小时，然后测定各抑菌圈直径。
[0099] G、管碟法的线性考察，其直线的最低浓度段与最高浓度段的确定，选择所致抑菌 圈直径在18~22_高的浓度为最高浓度，按中心浓度等比的关系，算出最低浓度，最低浓度 涵盖效价测定时高、低剂量之比4:1的低剂量浓度，最低浓度对应的直径不得少于14_。 [0100] H、以各组浓度的对数值log与相对应各浓度的直径与中心点浓度直径的差值作线 性分析，得回方程及相关系数r，并对相关系数作显著性检验，同时绘制线性图。
[0101] 通过以上试验及线性图证实，恩拉霉素标准液的浓度8.192μg/ml~48.83μg/ml (对数浓度值)中均与所产生的抑菌圈区域直径呈线性关系。
[0102] 实施例4
[0103]恩拉霉素检定培养基的制备
[0104] (1)称取蛋白胨5g、肉膏4.6g、NaCl 18g、磷酸氢二钠2.2g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
[0105] (2)用6M NaOH试液调步骤（（1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9~8.1，混合物分装。
[0106] (3)灭菌:将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
[0107] 实施例5
[0108] 恩拉霉素检定培养基的制备
[0109] (1)称取蛋白胨5g、肉膏3.8g、NaCl 18g、磷酸氢二钠2.6g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
[0110] (2)用6M NaOH试液调步骤（（1)所述的1 OOOrnL混合物pH值，使灭菌后1 OOOrnL混合物 的pH值为7.9~8.1，混合物分装。
[0111] (3)灭菌:将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
[0112] 实施例6
[0113] 恩拉霉素检定培养基的制备
[0114] (1)称取蛋白胨5g、肉膏4.4g、NaCl 20g、磷酸氢二钠2.4g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
[0115] (2)用6M NaOH试液调步骤（（1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9~8.1，混合物分装。
[0116] (3)灭菌:将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
[0117] 实施例7
[0118]恩拉霉素检定培养基的制备
[0119] (1)称取蛋白胨5g、肉膏5g、NaCl 20g、磷酸氢二钠3.0g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
[0120] (2)用6M NaOH试液调步骤（（1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9~8.1，混合物分装。
[0121 ] (3)灭菌:将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
[0122] 实施例8
[0123] 恩拉霉素检定培养基的制备
[0124] (1)称取蛋白胨6g、肉膏4.0g、NaCl 20g、磷酸氢二钠3.5g、琼脂14g，加蒸馏水使成 lOOOmL混合物；
[0125] (2)用6M NaOH试液调步骤（（1)所述的lOOOmL混合物pH值，使灭菌后lOOOmL混合物 的pH值为7.9~8.1，混合物分装。
[0126] (3)灭菌:将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
【主权项】
1. 一种恩拉霉素检定培养基，其特征在于所述培养基按重量计包括蛋白胨5-6份、肉膏 3-5份、NaCl 18-20份、磷酸氢二钠2.2-3.5份、琼脂14份。2. 如权利要求1所述的恩拉霉素检定培养基，其特征在于所述恩拉霉素检定培养基按 重量计包括蛋白胨5份、肉膏4.4份、NaCl 20份、磷酸氢二钠2.4份、琼脂14份。3. 如权利要求1或2所述的恩拉霉素检定培养基，其特征在于所述恩拉霉素检定培养基 pH 值为 7.8-8.1〇4. 如权利要求1或2所述的恩拉霉素检定培养基，其特征在于所述培养基的制备方法包 括： (1) 称取蛋白胨5份、肉膏3-5份、NaCl 18-20份、磷酸氢二钠2.2-3.5份、琼脂14份，加蒸 馏水使成l〇〇〇mL混合物； (2) 用6M NaOH试液调步骤①所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物的pH值 为7.9~8.1，混合物分装； (3) 灭菌:将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。5. 如权利要求4所述的恩拉霉素检定培养基，其特征在于所述培养基的制备方法包括： (1) 称取蛋白胨5份、肉膏4.4份、NaCl 20份、磷酸氢二钠2.4份、琼脂14份，加蒸馏水使 成1000mL混合物； (2) 用6M NaOH试液调步骤（（1)所述的1 OOOmL混合物pH值，使灭菌后1 OOOmL混合物的pH 值为7.9~8.1，混合物分装； (3) 灭菌:将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
【专利摘要】为了克服管碟法的边缘不清晰的缺陷，本发明提供一种恩拉霉素微生物效价测定的检定培养基，该培养基按重量计包括蛋白胨5-6份、肉膏3-5份、NaCl？18-20份、磷酸氢二钠2.2-3.5份、琼脂14份；本发明还涉及该恩拉霉素微生物效价测定的检定培养基制备方法，以及新的检定培养基在恩拉霉素微生物效价测定中的应用。
【IPC分类】C12Q1/18
【公开号】CN105524975
【申请号】CN201510998021
【发明人】唐阳刚, 李敬辉, 徐新军, 黄洁云
【申请人】丽珠集团新北江制药股份有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月24日