IPA的（3Z，5S)-5-(^基甲基甲基-1， 1/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲基朽的溫热(40-50°C)溶液中直到出现浑浊，使混合 物冷却至室溫。
[0129] 表1II:通过添加反溶剂的结晶
[0130]
[0131]
[0132] 将IPA/水结晶条件应用于粗同分异构混合物。在溶解于IPA(8vol)和加入水 (18vol)之前，首先将甲苯溶液浓缩至干燥。不幸地是，运样得到分层为油状物的材料。
[0133] 在另一实验中，在室溫下将反溶剂加入到粗（3Z，5S)-5-(^基甲基甲 基-1,1/-联苯-4-基)幾基Μ咯烧-3-酬0-甲基朽(90.4%面积的纯度，含0.5%w/w甲苯和 3.7%w/w TH巧的溶液中，直到出现浑浊，将混合物静置在室溫中（表1V)。
[0134] 表1V:通过在18-22°C下添加水的结晶
[0135]
[0136] 在该研究点上，还未鉴定出纯（3Z，5S)-5-(^基甲基)-1-[(2/-甲基-1,1/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲基朽的结晶的合适条件，或允许分离含（3Z，5S)-5-(^基甲 基)-1-[ (2/ -甲基-1，1/ -联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲基朽的固体的合适条件。
[0137] 使用（3Z/E，5S)-5-(^基甲基)-1-[ (2/ -甲基-1，1/ -联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲基目亏的粗同分异构混合物进行进一步的结晶尝试。在所有情况下，溶剂的体积小于 之前所使用的体积并且仅基于单一溶剂。将用于此结晶的粗材料化/Z比例为33:67和纯度 化+Z)为79.52 %面积)浓缩至泡沫(表V)。
[0138] 表V:来自更低体积的单一溶剂的结晶
[0139]
[0140]
[0141] 使用乙酸乙醋结晶之后在冰箱中陈化过夜，得到使用纯（3Z，5S)-5-(^基甲基)-1-[ (2/-甲基-1，1/-联苯-4-基)幾基Μ咯烧-3-酬0-甲基朽材料的结晶，但是其随着样品 升溫很快重新溶解。即使加入晶种，使用溶于乙酸乙醋的粗材料也观察不到晶体。
[0142] 使用二乙酸结晶之后在冰箱中陈化，得到使用粗（3Z/E，5S)-5-(^基甲基）-1-[皆-甲基-1，！/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲基朽材料的结晶。收集固体，回收率为 41%。不幸的是，所收集到的固体与投入的材料相比具有稍差的E/Z比例和稍高的化学纯 度。
[0143] TBME作为纯Z和粗品的溶剂时，在冰箱中陈化后都得到油状物，并且在有或没有晶 种的情况下在冰箱中陈化后都保留在溶液中。
[0144] 仍未找到使Z/E比例和同分异构混合物化+Z)纯度改进的粗同分异构混合物的合 适结晶条件。
[014引1.4(32,55)-5-(径基甲基)-1-[(2/-甲基-1，1/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0- 甲基朽的基本上纯的形式
[0146] 1.4.1小规模纯化
[0147] 通过朽醋还原后分离的粗同分异构混合物(实施例1的阶段7)的色谱法进行基本 上纯的形式的（3Z，5S)-5-(H基甲基)-1-[(2/-甲基-!，！/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬 0-甲基目亏的分离过程，所述色谱法使用Biotage系统（Biotage AB，SE-751 03Uppsala， Sweden)。
[014引通过Biotage色谱法纯化五个不同批次(No. 020、180、062、068、076)的粗同分异构 混合物。此外，对于批次No . 068和076使用不同的条件。用添加的5 % w/w尖峰的目亏甲基醋 (No. 068)和过载的Biotage柱(No. 076)进行纯化。
[0149] 使用已经用甲苯预冲洗的Biotage 40M筒(40g二氧化娃)进行各色谱法。然后用甲 苯:Me0H(99:lv/v)洗脱并WlOOml的级分收集（总体积为化），随后用甲苯:MeOH(96:4v/v) 冲洗。
[0150] 通过化C(洗脱液：乙酸乙醋）分析级分W确定哪个级分可被丢弃W及哪个级分含 有Z异构体。然后通过HPLC分析运些Z级分。级分的通过标准是Z异构体>96%和E异构体< 1.2%。
[0151] 出人意料地，通过Biotage色谱法对多个批次进行的纯化非常有效，因为基本上纯 的形式的（3Z，5S)-5-(^基甲基)-1-[(2/-甲基-!，！/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲 基朽被纯化到99.4%(批次齡.020、齡.062、齡.068)和99.2%(批次齡.180、齡.076)。特别 地，在目亏醋的存在下，Biotage色谱法去除了5%w/w目亏醋（批次No.068)，而对回收率或质量 没有损害，Bio化ge柱的25%的过载没有造成产率或质量的减少(批次No. 076)。
[0152] 表VI: Bio化ge色谱法的效率
[0153]
[0154]
[015引1.4.2大规模纯化
[0156] 将多批次的粗(3Z/E，5S)-5-(^基甲基)-1-[(2/-甲基-1,1/-联苯-4-基)幾基]化 咯烧-3-酬0-甲基朽（0.3924邑，1.16111〇1，1.0巧*)作为溶于甲苯的约50%巧/^溶液加入到 Biotage 150L SIM单元中，用溶于甲苯（150L)的1%甲醇W及随后用溶于甲苯(5化)的2% 甲醇纯化，级分大小为5.化。视情况而定，通过化护 5和HPLC分析法来分析所收集的级分。将 被认为含干净的（3Z，5S)-5-(^基甲基)-1-[(2/-甲基-1,1/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲基朽(标准:Z-异构体> 96.00%面积，E-异构体。.20%面积）的级分合并并在真空 下于40至45°C浓缩。在残余物中加入无水乙醇（2x2L)，并在真空下于40至45°C浓缩溶液直 到泡沫状固体可被操作。得到为浅白色至淡褐色固体的所需产品，即（3Z，5S)-1-[(联苯-4-基-幾基)-5-径基-甲基]化咯烧-3-酬-0-甲基朽(0.089蛇，22.7%巧/巧神醒1?化0(：13)和结 构一致，HPLC的面积为99.3 %，Z/E比例为98，4:0.9)。
[0157] 表VII:对不同批次的基本上纯的形式的（32,55)-5-巧圣基甲基)-1-[(2/-甲基-1， 1/-联苯-4-基)幾基]邮咯烧-3-酬0-甲基朽的纯化的概括
[015 引
[0159]
[0160]将从Biotage色谱法分离的合适批次的（3Z，5S)-5-(^基甲基)-1-[(2'-甲基-1， 1^-联苯-4-基)幾基]邮咯烧-3-酬0-甲基朽(2.7131^，1金〇合并，并在15至25°0下溶于无 水乙醇（5.1化，2. Ovol)，通过玻璃微纤维纸过滤得W澄清，并用无水乙醇(0.5化，0.2vol) 洗涂过滤器。在真空下于40至45°C分批浓缩合并的滤液。将生成物转移到干燥盘中，并在真 空下于30°C干燥24小时。然后在80小时内将烘箱溫度从30逐步增加到40°C。通过iH NMR分 析(CDC13)测定残余溶剂的水平，并且当发现其<1.0%w/w时，将固体通过500皿孔径的筛。 将固体放回烘箱，在40至42°C下干燥直到溶剂水平<0.40%w/w，得到（3Z，5S)-1-[(联苯-4-基-幾基)-5-径基-甲基]-化咯烧-3-酬-0-甲基朽(2.633蛇，97.1%讯/讯，1!1醒1?化0(：13) 和结构一致，HPLC的面积为98.65 % )。
[0161 ]合并过程概括如下：
[0162] 输入:2.713kg
[0163] 输出：2.633kg
[0164] 产率:97.1%w/w 巧1巧]实施例2:(3Z，5S)-5-(%基甲基)-1-[(2/-甲基-1,1/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲基朽与0T-R和加压素 Via受体的结合
[0166] 与0T-R和加压素 Via受体结合
[0167] 使用闪烁邻近测定法体外测量对人类催产素受体的竞争性结合。
[0168] 该测定法允许测定测试化合物对0T-R的亲和力。将来自皿K293EBNA(表达0T-R的 细胞)的膜悬浮在含50mM Tris-肥1、抑7.4、5mM MgC12和0.1%BSA(w/v)的缓冲液中。将膜 (2-化g)与0.1 mg包被有小麦胚芽凝集素的SPA珠(来自Amersham的WGA-PVT-聚乙締亚胺珠） 和0.2nM的125放射性标记的[I ]-0VTA(0VTA为鸟氨酸血管活性的，用于竞争性结合实验的 οτ类似物）混合。在ΙμΜ催产素存在下测定非特异性结合。总的测定体积是100μΙ。将板（ Corning ? NBS板)在室溫下解育30分钟，并在Μ化I'Obeta愈板闪烁记数器上计数。 在W下浓度的本发明化合物的存在下进行竞争性结合：30μΜ、10μΜ、1μΜ、300ηΜ、100ηΜ、 lOnM、1ηΜ、100ρΜ、lOpM。使用迭代、非线性曲线拟合程序"Prism"(Gra曲Pad Software，Ine) 分析竞争性结合数据。
[0169] 使用上述体外生物学测定来评估本发明化合物抑制I-0VTA与0T-受体结合的能 力。上述实施例中测试化合物的结合亲合力由抑制常数化i;nM)表示。从运些值中，可W得 出本发明的所述测试化合物确实表现出显著的对催产素受体的结合。
[0170] (3Z，5S)-5-(^ 基甲基)-1-[(2/-甲基-1,1/-联苯-4-基)幾基 Μ 咯烧-3-酬 0-甲 基月亏对催产素受体的抑制常数Ki是Ki(nM)=52nM，对加压素 Via受体是Ki(nM) = 120nM。因 此，（3Z，5S)-5-婚基甲基)-1-[(2/-甲基-1，！/-联苯-4-基)幾基]邮咯烧-3-酬0-甲基朽对 催产素受体具有选择性。 巧171]实施例3:(3Z，5S)-5-(%基甲基)-1-[(2/-甲基-1,1/-联苯-4-基)幾基]化咯烧-3-酬0-甲基朽是0T-R括抗剂
[0172] 通过化IPR(巧光成像平板读数器)测量对0T-R转染的皿K293邸NA细胞中的催产素 诱导的化化迁移的抑制。
[0173] 该测定允许通过化合物（3Z，5S)-5-(^基甲基)-1-[(2/-甲基-1,1/-联苯-4-基） 幾基]化咯烧-3-酬0-甲基朽测量对0T/0T-R介导的巧迁移的抑制。
[0174] FLIP及吸是一种巧光成像装置，其使用激光(氣离子激光）用于同时照射并阅读 (冷却的CCD照相机)96-孔板的每个孔，因此能快速测量大量样品。
[01巧]制备板：FLIPR-板用化L(聚-1^-赖氨酸）10μg/ml+0.1%明胶预先包被W附着 肥K293邸NA细胞(表达0T-R的人胚胎肾脏细胞），在37°C下解育30分钟至多达2天。将细胞移 植(plate out)到96-孔板中（60000细胞/孔）。
[0176] 用氣-4标记：将50yg的氣-4(Ca2 +敏感的巧光染料）溶解在20μ1普流尼克酸 (pluronic acid)中（20%在DMS0中）。然后将溶解的氣-4稀释在 10ml DMEM(Dubecco ' S Minimal Essential Medium)-F12培养基中。用DMEM-F12培养基将板洗涂一次。将100μΙ的 含氣-4的DMEM-F12培养基加入到皿Κ-细胞中，后者在该巧光培养基中解育1.5-化。氣-4被 细胞的细胞质摄取。
[0177] 缓冲液：145mM 化Cl、5mM KCl、lmM MgC12、10mM Hepes、10mM葡萄糖、EGTA(