一示例中，BP是检测免疫抑制分子环抱霉素的（环状排列)亲环蛋白A，环抱霉 素用于治疗器官移植后的患者、和患有自身免疫素乱的患者。
[0027] 融合蛋白中Luc和BP的相对顺序是其允许在传感器处于闭合状态时（即当内源配 体L结合BP时）于Luc和巧光团受体之间产生高BRET效率，并且当传感器处于开放状态时在 Luc和合成巧光团之间产生低BRET效率。然而，功能性传感器不必然在传感器开放后显示 RET效率的降低，但只要传感器开放后发生彻底变化，其还可反转。通常，BP位于传感器分子 的子末端，L位于另一末端。然而，BP、Luc和合成的调节分子的特异结合的结合位置的最佳 顺序取决于BP的结构，尤其是BP的末尾相对于配体结合位置的空间排列。在一个实施方式 中，BP通过其N-末端融合至Luc。然而，若BP的几何形状使其N末端与配体/分析物结合位置 的距离比C末端更高，则融合蛋白的顺序可反转从而实现闭合状态中Luc和巧光团之间的紧 密相邻。因此，还提供BP通过其C末端融合至Luc的传感器分子。Luc与BP的融合可为直接或 间接(例如通过接头序列）。多肤序列可为天然或非天然序列。通常，Luc和BP之间的空间为 0-10、优选0-4个氨基酸。
[0028] 含Luc和BP的蛋白质部分系连至合成的调节分子。合成的调节分子优选W位置特 异方式系连至蛋白质部分W确保单一同源产物。结合位置可从蛋白质部分的任何部分进行 选择，即Luc、BP或存在的其他任何(接头)序列。合成的调节分子结合至蛋白质部分的位置 经选择，从而当传感器分子在开放和闭合构型之间变化时其允许BRET信号变化。在一个实 施方式中，合成分子系连至Luc的N末端，从而顺序是(合成的调节分子)-Luc-BP。
[0029] 合成的调节分子的位置特异结合可通过本领域已知方法实现。例如，可合适地使 用显示独特反应性的氨基酸(天然或非天然）。合适的氨基酸包括合适的合成的调节分子的 半脫氨酸和其上允许位置特异性化学偶联反应(例如点击化学）的任何(非天然)氨基酸。例 如，可使用非天然氨基酸叠氮基高丙氨酸(AHA)。
[0030] 在另一实施方式中，合成的调节分子W位置特异的方式通过蛋白质标记标签系连 至蛋白质部分。优选地，所述蛋白质标记标签是本领域已知的自标记蛋白质，例如SNAP-标 签、CLIP-标签或化Ιο-标签，且其中所述合成的调节分子通过合适的反应基团进行系连。在 一个实施方式中，自标记蛋白质标签基于人〇6-甲基鸟嚷岭-DNA烷基转移酶化AGT)，合成的 调节分子通过针对hAGT的反应基团与之系连。例如，所述蛋白质标签是SNAP-标签或化ΙΡ- 标签。所述反应基团优选〇6-苄基鸟嚷岭(BG)、04-苄基-2-氯代-6-氨基喀晚(CP)或0 2-苄基 胞喀晚(BC)衍生物。在另一实施方式中，自标记蛋白质标签基于修饰的面代烧控脱面酶，合 成的调节分子通过氯烧控化alo-标签)与之系连。
[0031] 或者，蛋白质标记标签可为通过酶的作用标记有合成的调节分子的标签，所述酶 例如分选酶(和其突变体）、硫辛酸连接酶(和其突变体）、生物素连接酶(和其突变体）、憐酸 泛酷琉基乙胺转移酶(PPTase;和其突变体）。标记可通过直接转移载有合成的调节分子的 分子至蛋白质标签来实现，或通过两部法来实现，其中第一步中含生物正交基团的分子结 合，第二步中所述生物正交基团与含合适功能基团的合成的调节分子反应。例如，载有合成 的调节分子的修饰的憐酸泛酷琉基乙胺衍生物的酶转移使得源自酷基载体蛋白的某些肤 序列内的特定丝氨酸受到标记，并因此允许合成的调节分子精确连接所述蛋白中存在的一 个残基（参见N.George等.J Am Chem Soc.2004 126,8896)。ACP-标签和MCP-标签是源自酷 基载体蛋白的此类序列。憐酸泛酷琉基乙胺转移酶的存在是ACP-标签或MCP-标签与其底物 之间形成共价键所需，其为辅酶A(CoA)的衍生物。在标记反应中，偶联CoA的基团通过憐酸 泛酷琉基乙胺转移酶共价结合ACP标签或MCP标签。两步策略的示例是运样一种标记，其中 在第一步中，硫辛酸连接酶化plA)的突变体将反式环辛締衍生物连接到LplA受体肤上， LplA受体肤为传感器分子的一部分。在第二步中，连接的反式环辛締是用偶联四嗦的合成 的调节分子化学选择性衍生的。该两步法的详细内容参见Liu等(J Am Chem Soc.2012年1 月 18 日；134(2):792-5)。
[0032] 或者，合成的调节分子通过基于内含肤的标记而位置特异地系连至蛋白质部分。 例如，使用所谓表达的蛋白连接(T.Muir, Annu. Rev. Biochem. 2003.72:249-289)会使得蛋 白质部分表达为具有C末端内含肤的融合蛋白，并且随后相应C末端硫醋发生分离。然后该 硫醋与合成的调节分子所连接的半脫氨酸残基反应，形成功能性传感器分子。在基于断裂 蛋白质内含肤（split-intein)的蛋白质标记（Volkmann G,Liu X-Q(2009)PL〇S 0肥 4 (12) :e8381)中，传感器分子的蛋白质部分可表达为具有C或N末端断裂蛋白质内含肤的融 合蛋白。添加代表断裂蛋白质内含肤的其他部分并且也载有所述合成的调节分子的合适的 合成肤产生如下结果:功能性内含肤的形成、从蛋白质中后续剪切内含肤、W及形成功能性 传感器分子(Volkmann G,Liu X-Q(2009)PL〇S 0肥 4(12) :e8381)。
[0033] 优选地，传感器分子中的合成的调节分子的特异结合位置通过蛋白质接头部分与 蛋白质部分的其他部件连通。接头部分可为人工多肤序列或天然产生的蛋白质，设计用于 确保合成的调节分子和传感器的开放状态中的巧光素酶之间充分的距离。
[0034] 聚L脯氨酸接头可用作精确分子标尺，由于其在水溶液中形成每个残基3.1 λ螺距 的稳定和刚性螺旋结构（聚脯氨酸II螺旋)方面的明确性质。因此，接头部分优选富含脯氨 酸的螺旋接头，产生结构刚性并使得合成的调节分子从连接的巧光素酶分离。用由至少15 个脯氨酸残基组成的聚L脯氨酸接头（例如Proi日或Pr〇3〇或更长）获得良好效果。Brim等 (2011)研究了插入传统传感器中的SNAP-和化IP-标签之间的各种长度的聚脯氨酸接头(0， 6，9，12，15，30，60)。发现长度为30或60个脯氨酸残基产生改善的传感器最大比率变化。因 此，在一个实施方式中，接头部分由聚L脯氨酸接头组成，包括至少15、优选至少20、更优选 至少30个残基。
[0035] 合成的调节分子包含能与BP进行分子内结合的配体化），W及能接受来自Luc的能 量的巧光受体，所述能量在它们空间上邻近时发出。通常，L位于调节分子的游离端，允许与 BP的有效相互作用。优选地，传感器组分的相对顺序为在传感器的开放状态中，合成的调节 分子与巧光素酶之间的距离尽量远。合成的调节分子的设计和制备根据本领域已公开的内 容在传统基于FRET的Snifit上进行。参见例如化un等.J Am化em Soc.2009;131(16): 5873-84;E5;run等.J Am Qiem Soc. 2011; 133(40): 16235-42;E5;run等.J Am Qiem Soc. 2012; 134(18):7676-8。
[0036] 选择巧光受体分子与巧光素酶一起发挥BRET对的功能，即用于接受存在合适Luc 底物时来自Luc的生物发光能量。此外，巧光受体分子适用于在接受生物发光后发射光。选 择基于巧光素酶发射光谱和/或传感器分子的应用。形成BRET对的合适巧光受体包括任何 巧光团，其激发光谱与对应巧光素酶的发射光谱至少部分重叠。可在本发明传感器分子中 用作发光受体的可系连的巧光团包括Alexa Fluor染料，具体为Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 594;花青染料例如切3，切3.5，切5，切7及其衍生物，具体为横酸盐衍生物；SYTO染 料；SYBR染料，Bodipy染料；巧光蛋白例如EGFP和mCher巧;Atto染料例如Atto647N;若丹明 染料例如簇基四甲基若丹明（TMR)，德克萨斯红，娃若丹明；巧光素衍生物例如簇基巧光素 和FITC;俄勒冈绿；Ξ芳基甲烧染料如孔雀石绿；糞酷亚胺染料如蛋光黄；咕吨染料例如 SNARF-1;日丫晚染料例如日丫晚澄;香豆素；I畑ye染色例如I畑ye 700DX。非常合适的受体包括 切3和TMR。
[0037] 本领域技术人员应理解，通过选择合适的结合蛋白和分子内配体的对，本发明的 传感器分子可设计用于检测任何感兴趣的分析物。若配体和分析物与结合蛋白的结合相互 排斥，那么对没有游离分析物时待进入闭合状态的传感器分子来说，配体对结合蛋白的亲 和性必须足够强。若配体和分析物与结合蛋白的结合相互协同，那么对存在游离分析物时 待进入闭合状态的传感器分子来说，配体对结合蛋白的亲和性必须足够强。在一个实施方 式中，结合蛋白和配体之间的相互作用的强度由平衡解离常数化d)表征，高至100μΜ、优选 高至50、更优选高至ΙΟμΜ。
[0038] 例如，感兴趣的分析物是药物、代谢物、蛋白质、生物标记物或核酸分子。在优选实 施方式中，分析物是药物，其前体或代谢物。优选使用本发明传感器在各种临床设定中测量 血液、血清或血浆的药物浓度，例如用于监控治疗、证实住院患者的中毒诊断、甚至协助法 医学死亡研究。
[0039] 在一个实施方式中，提供检测下述药物的传感器:抗癌药例如氨甲蝶岭或免疫抑 制药例如雷柏霉素、或抗细菌药例如甲氧节晚、或用于治疗屯、脏病症的药物例如地高辛、或 抗癒痛药例如托化醋。
[0040] 在另一实施方式中，感兴趣的分析物是生物标记物。本文所用生物标记物或生物 标记是生物状态的指示剂，或具是体类型的生物体W前存在或当前存在的指示剂。使用本 发明传感器作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药学响应的指示剂，可客观测量 并评估生物标记物。
[0041] 本领域技术人员应理解，本发明传感器分子可设计用于检测任何感兴趣的分析 物。
[0042] 在第一具体方面，传感器包含人碳酸酢酶化CA)作为ΒΡ，优选与作为分子内配体的 4-(氨基甲基）苯横酷胺或其变体组合。如图1所示，该传感器优选用于分析托化醋 (Topamax)或任何其他HCA配体。
[0043] 在第二具体方面，本发明提供的传感器分子中BP是二氨叶酸还原酶(DHFR)或其环 状排列的变体。优选地，BP与作为分子内配体的甲氧节晚、氨甲蝶岭或其变体组合使用。如 图2所示，该传感器优选用于分析氨甲蝶岭、甲氧节晚或其他D!FR配体。
[0044]