osetta-gami株系中表达并用C末端化S标签W及N 末端Str邱标签纯化。通过用合成分子BG-切3-tmp标记SNAP标签来组装传感器分子（图1B)。 纯化的蛋白质在肥阳S缓冲液巧OmM肥阳S，50mM化Cl，pH 7.2)中稀释至化1，并与4倍摩尔 过量的合成化合物BG-Cy3-tmp室溫解育一小时。
[0095] 为了测试对不同氨甲蝶岭浓度的响应，组装的传感器分子在补充有100μΜ NADPH 的10化L皿PES缓冲液中稀释至lOnM的浓度，所述缓冲液在白色非结合96孔板中含有限定 浓度的氨甲蝶岭(奥地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司）。室溫解育溶液至少 30分钟W确保传感器达到平衡。生物发光在Envision多标记读数计(Multilabel Reader) (帕金埃尔默公司）上进行测量:测量前5秒，将在皿PES缓冲液中稀释100倍的10化L复立玛 津(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)储液通过仪器注射器加入孔中并收集信号，用伞形 酬(Umbe 11 if erone)发射滤器(波长:460nm，带宽：25nm)记录化noLuc发射和用切3滤器（波 长：595nm，带宽：60nm)记录Cy3发射。
[0096] 图2D显示传感器对不同氨甲蝶岭浓度的响应。低浓度时，传感器为闭合构型，允许 从化noLuc向切3的高效共振能量转移，并导致低化noLuc/切3发射比率。高氨甲蝶岭浓度 时，分子内配体被置换，传感器切换为开放构型状态。该状态中从NanoLuc向切3的共振能量 转移无效，导致高NanoLuc/Cy3发射比率。
[0097] 应理解，传感器可用于结合DHFR的其他(药物)分析物，例如培美曲塞、乙胺喀晚、 氯脈、甲氧节晚等。
[009引实施例3:地高辛传感器
[0099] 构建能传感地高辛浓度的BRET传感器。其基于计算机设计的结合蛋白（DHFR) (Tinberg等化化re 2013已接受），孕酬作为分子内配体，巧光素酶和TMR作为BRET对(参加 图3A、B)。
[0100] 含06-苄基鸟嚷岭(BG)基团用于SNAP-标签标记、巧光团四甲基若丹明（TMR)和作 为系连配体的孕酬的分子根据方案3合成。
[0101] 方案3:合成分子BG-TMR-prog的方案示例。
[0102]
[0103] 孕酬-(3-0-簇甲基)朽（III-l)通过偶联至l-N-Boc-3,6-二氧杂-1，8-二氨基辛烧 (ΠΙ-2)的肤系连至短阳G2系连体(tether),得到111-3,然后通过用Ξ氣乙酸(TFA)处理移 除Boc保护基团，得到氨基衍生物111-4。如上所述制备BG-EGu-TMR-COOH(I-l)(化un等.J Am Chem Soc.2009;131(16):5873-84;Kvach等.Bioconjug Chem.2009,20(8),1673-82)并 且将其与（IΠ -4)偶联，W得到标记化合物BG-TMR-prog(II1-5).
[0104] 用标准克隆技术构建DIG10.3、化noLuc巧光素酶(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格 公司）、30-脯氨酸接头和SNAP-标签的融合蛋白。DIG10.3通过其C末端进行融合，因其位置 靠近蛋白质的结合位置。运可使NanoLuc巧光素酶结合至靠近分子内配体的结合位置，将其 靠近闭合态传感器的受体巧光团TMR。融合蛋白在大肠杆菌化.coli)Rosetta-gami株系中 表达并用C末端化S标签W及N末端Strep标签纯化。
[0105] 通过用合成分子BG-TMR-prog标记SNAP标签来组装传感器分子（图3B)。孕酬与 DIG10.3结合较弱。其因此虽靠近传感器但仍容易被地高辛置换，使得传感器比使用地高辛 作为系连配体时更灵敏。纯化的蛋白质在肥PES缓冲液(50mM肥PES，50mM化Cl，pH7.2)中 稀释至ΙμΜ，并与4倍摩尔过量的合成分子BG-TMR-prog室溫解育一小时。
[0106] 为了测试对不同地高辛浓度的响应，组装的传感器分子在1(Κ)化正常人血清（马萨 诸塞州比尔里卡的默克密理博公司）中稀释至lOnM，所述血清在白色非结合96孔板中含有 限定浓度的地高辛(奥地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司）。室溫解育溶液至 少10分钟W确保传感器达到平衡。生物发光在Envision多标记读数计(帕金埃尔默公司）上 进行测量:测量前5秒，将在肥PES缓冲液中稀释100倍的1(Κ)化复立玛津(威斯康辛州菲奇堡 的普洛麦格公司)储液通过仪器注射器加入孔中并收集信号，用伞形酬(Umbelliferone)发 射滤器(波长:460加1，带宽：25皿)记录化noLuc发射和用切3滤器(波长:595加1，带宽：6化m) 记录TMR发射。
[0107] 图3C显示传感器对不同地高辛浓度的响应。低浓度时，传感器为闭合构型，允许从 化noLuc向TMR的高效共振能量转移，并导致低化noLuc/TMR发射比率。高地高辛浓度时，分 子内配体被置换，传感器切换为开放构型状态。该状态中，从化noLuc向TMR的共振能量转移 无效，导致高NanoLuc/TMR发射比率。
[0108] 实施例4:FK506传感器
[0109] 构建能感测免疫抑制分子FK506浓度的BRET传感器。其基于FKBP12作为结合蛋白， FKBP的双特异抑制剂作为分子内抑制剂，和巧光素酶和Cy3作为BRET对(参见图4A、B)。
[0110] 含ο6-苄基鸟嚷岭（BG)基团用于SNAP-标签标记、巧光团Cy3和作为系连配体的 FKBP双功能配体(f kl)的分子根据方案4合成。合成方案由双位置特异的FKBP-配体聚合组 成，然后与短阳G-接头连接。根据前述程序(Rohrig等.化emMed化em 2007，2，1054-1070)， 进行一些修改，通过用皿TU 4-氨基苯酪（IV-1)和4-径基苯甲酸（IV-2)偶联得到IV-3来制 备第一配体。两种不同等分Ξ甘醇双-对甲苯横酸醋（IV-4)与各1当量的邻苯二甲酯亚胺钟 或叠氮化钢在DMF中反应，分别得到IV-5和IV-6JV-3在DMF中经过2步烷基化，使用碳酸钢 作为碱:加入第一当量的IV-5W烷基化大多数反应型酪醒基团，然后加入过量IV-6W进行 第二反应性径基基团的烷基化，得到IV-7。用40%甲基胺水溶液移除邻苯二甲酯亚胺保护 基团，获得IV-8中的游离氨基基团。分别制备第二配体:3'，4'，5'-Ξ甲氧基苯乙酬（IV-9) 用二氧化砸在化晚中氧化得到酸IV-10,其与TSTU偶联至脯氨酸甲醋（IV-11)并用1Μ氨氧化 钢水溶液处理W水解甲醋并得到IV-12JV-8和IV-12用TSTU偶联，得到叠氮基-修饰的双特 异配体IV-13。BG-EGll-NH2(II-6)和Cy3(II-5)如前所述进行制备（Brun等.JAm畑em Soc.2009; 131(16) :5873-84;化un等.J Am Chem Soc.2011; 133(40) :16235-42),两个构建 嵌合物与烘丙胺偶联在一起得到烘-修饰的BG-切3-烘(IV-14)dIV-13通过点击化学用硫酸 铜（Π )、Ξ[(1-苄基-1Η-1，2,3-Ξ挫-4-基）甲基]胺和抗坏血酸钢在DMS0中偶联至IV-14， 并得到标记化合物BG-Cy3-f kl (IV-15)。
[0111] 通过将传感器SNAP-PP30-NanoLuc-HCA(参见实施例1)中的HCA编码序列置换为 FKBP12编码序列，构建SNAP-标签、30-脯氨酸接头、NanoLuc巧光素酶(威斯康辛州菲奇堡的 普洛麦格公司）和FKBP12的融合蛋白。融合蛋白在大肠杆菌化.coli)Rosetta-gami株系中 表达并用C末端化S标签W及N末端Strep标签纯化。
[0112] 通过用合成分子BG-切3-fkl标记SNAP标签来组装传感器分子（图4B)。该先前公开 的配体由两部分组成，并结合至F邸P12的两个不同位点。第二部分-直接连接至BG-切3-fkl 中的切3-与蛋白质的N末端紧密结合(Rohrig等.化emMed化em 2007，2，1054-1070.)。运使 得切3靠近闭合态传感器中的化noLuc巧光素酶，允许高效BRET。纯化的蛋白质在肥PES缓冲 液巧OmM肥阳S，50mM NaCl，pH 7.2)中稀释至lμM浓度，并与4倍摩尔过量的合成化合物BG- Cy3-fkl室溫解育一小时。
[0113] 为了测试对不同FK506浓度的响应，组装的传感器分子在1(Κ)化正常人血清（马萨 诸塞州比尔里卡的默克密理博公司）中稀释至InM，所述血清在白色非结合96孔板中含有限 定浓度的FK506(奥地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司）。室溫解育溶液至少 10分钟W确保传感器达到平衡。生物发光在化Vision多标记读数计(帕金埃尔默公司）上进 行测量:测量前5秒，将在肥PES缓冲液中的10化L lyg/mL腔肠素-h(亚利桑那州派恩托普纳 米光公司（NanoLight，Pinetop，AZ))通过仪器注射器加入孔中并收集信号，用伞形酬 (Umbellife;rone)发射滤器(波长:460皿，带宽：25皿)记录NanoLuc发射和用切3滤器(波长： 595nm，带宽：60nm)记录Cy3发射。
[0114] 图4C显示传感器对不同FK506浓度的响应。低浓度时，传感器为闭合构型，允许从 NanoLuc向切3的高效共振能量转移，并导致低化noLuc/切3发射比率。高FK506浓度时，分子 内配体被置换，传感器切换为开放构型状态。该状态中从化noLuc向切3的共振能量转移无 效，导致高NanoLuc/Cy3发射比率。
[0115] 传感器当然可用于结合FKBP12的其他药物，例如雷柏霉素。
[0116] 实施例5:含服ET传感器的分析装置
[0117] 本实施例证明将BRET传感器固定或吸附于固体载体上，并且当其用于分析吸收蓝 光区域的样品时的惊人优势。为了测试人血清中不同浓度胆红素的效果，选取氨甲噪岭传 感器SNAP-Pro30-化noLuc-DHFRcpL24G5 (参见实施例2)作为制备分析装置的代表示例。在 正常人血清中用氨甲蝶岭的滴定服ET传感器，包含或不含ΙΟμΜ胆红素。
[011引如实施例2所述组装传感器分子。将其在补充有20ιχΜ胆红素或不补充的SOiiL正常 人血清中稀释至浓度lOnM，所述血清在白色非结合96孔板中含有限定浓度的氨甲蝶岭（奥 地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司）。室溫解育溶液至少10分钟W确保传感 器达到平衡。为