在第Ξ方面，本发明提供的传感器分子中的BP是计算机设计的地高辛结合蛋白 DIG10.3,优选与作为分子内配体的孕酬或其变体组合。如图3所示，该传感器优选用于分析 地高辛、地高新或其他DIG10.3配体。
[0045] 在第四具体方面，传感器分子包含FK506结合蛋白（F邸P)，优选与作为分子内配体 的Ξ甲氧基苯基脯氨酷胺N-苯甲酯苯胺或其变体组合。如图4所示，该传感器优选用于检测 FK506 (他克莫司）、雷柏霉素或其他FKBP配体。
[0046] 在另一方面，传感器分子包括亲环蛋白A(切pA)或其环状排列的变体作为BP，优选 与作为分子内配体的5-(对-氨基苄基)-海因酸化ydantoate)乙醋、环抱霉素 A或其变体组 合。该传感器用于检测环抱菌素 A或任何其他CypA配体。
[0047] 本发明还设及提供本发明传感器分子的方法。如实施例1-4所示，蛋白质部分和合 成的调节分子(或其前体)通常作为分别实体生成，之后使用合适的偶联反应将合成分子系 连至蛋白质分子。因此，所述方法包括提供蛋白质部分和合成的调节分子或其前体的步骤 和将它们组装产生传感器分子的步骤。
[004引蛋白质部分可用本领域技术人员已知的标准重组DNA技术制备。例如，通常可将BP 编码序列导入含巧光素酶序列的细菌表达载体的多克隆位点，从而BP序列可操作地连接至 Luc编码序列。其他蛋白质组分例如蛋白标记标签和/或接头序列也可用标准技术纳入。用 于本发明BRET传感器的蛋白质组分的各种构型的DNA构建体可转染/转化入合适的细胞系 (真核或原核）用于生产。各种构型的融合蛋白在细胞中生成，然后从转染/转化的细胞中纯 化或半纯化。纯化蛋白质部分的常规程序是通过亲和色谱，例如使用工程改造入DNA构建体 的化S-和/或Str邱-标签。可单独使用标准生化技术，或与亲和色谱组合使用，来纯化各种 融合蛋白至各种水平。最后，运些纯化的融合蛋白在系连至合成的调节分子之前还可经化 学或酶修饰。
[0049] 在另一实施方式中，蛋白质部分通过体内和体外方法的组合产生。首先融合蛋白 通常在细胞中用重组技术工程改造并表达。然后融合蛋白经纯化或半纯化，之后通过化学 或酶修饰连接其他蛋白质元件，例如可作为结合蛋白的元件例如抗体。结合其他元件可基 于肤或基于化学。
[0050] 合成的调节分子或其前体可通过偶联受体巧光团至分子内配体来合成，使用本领 域已知方法。本领域技术人员应理解所用方法可基于巧光团和/或配体的化学性质进行选 择。受体巧光团和分子内配体的偶联根据本领域已公开的内容在传统基于FRET的Snifit上 进行。而且，调节分子或其前体可包含介导与蛋白质部分的系连的元件。例如，若合成的调 节分子将通过自标记蛋白（例如SNAP-标签、CLIP-标签或化Ιο-标签)位置特异地系连至传 感器分子的蛋白质部分，所述合成的调节分子必须包含合适的反应基团例如用于hAGT、06- 苄基鸟嚷岭(BG)、04-苄基-2-氯代-6-氨基喀晚(CP)或02-苄基胞喀晚(BC)衍生物或氯烧控 的反应基团。介导系连的反应基团可优选通过含数个聚乙二醇(PEG)单元的间隔子偶联至 巧光团受体分子。例如，适合使用10-15PEG单元的间隔子。参见例如化un等.J Am畑em Soc.2009; 131 (16) :5873-84,示例如下所示。
[0051] 待与半脫氨酸或酶介导的偶联组合使用的调节分子可基于下述示例合成，其中BG 用马来酷亚胺置换用于半脫氨酸偶联，或用CoA衍生物置换用于通过憐酸泛酷琉基乙胺转 移酶的偶联。
[0052] 如本文所述，发明人观察到将比率型RET传感器直接用于定量吸收传感器发射波 长处的光的复杂样品（例如血清或其他体液）中的分析物易于产生假象，得到不可靠的分析 结果。发明人假定当光在样品中行进的距离降低时，改变所测比率的传感器发射的光的吸 收显著降低或甚至完全消失，从而来自样品组分的吸收不影响所测比率。发现运可通过将 待分析样品应用装置(载体)来实现，所述装置中从任意传感器分子发射的和由检测器收集 的光子穿过所述样品的（平均）距离短于约330μπι。具体地，当传感器吸附于纸时，BRET传感 器分子的性能显著增加。参见下述实施例5,其表明胆红素吸收对溶液中服ET传感器分子发 射的信号的效果相比胆红素吸收对吸附于白纸上的相同样品发射的信号的效果。然而，降 低路径长度的各种其他方法是可想象的。例如，当传感器固定于玻片或一些其他透明支持 物上时，W及当固定的传感器接触玻片对侧的样品后通过玻片检测BRET信号时，得到相似 的优良效果。此外，当含比率型传感器分子的样品作为薄膜应用到玻片表面上时，W及当通 过玻片的另一侧检测BRET信号时，得到相似的优良效果。可通过添加表面活性剂促进薄膜 的形成。
[0053] 因此，本发明还设及一种包含前述权利要求中任一项所述的BRET传感器分子的分 析装置，其中所述传感器分子w如下方式排列，当使用所述装置时，从所述传感器分子发射 的和由检测器收集的光子穿过所述样品的(平均)距离短于330WI1。
[0054] 在一个实施方式中，传感器分子固定于或吸附于固体载体。优选的载体包括玻璃 或透明塑料、凝胶和纸。
[0055] 优选的载体是纸和玻璃片。合适类型的纸包括本领域已知的用作纤维素色谱纸的 那些。例如，可使用Whatman公司销售的1级化r世界标准色谱纸，其为平滑表面、0.18mm厚， 线性流速(水)为130mm/30分钟。惊奇的发现吸附（点）在纸上的本发明传感器分子在例如- 20摄氏度储存数周后仍可使用。运打开了传感器应用的全新领域。具体地，预点在纸上的 BRET传感器可容易地在临床环境中使用，例如"床边"设定中，其中体液样品仅通过将样品 施加在含固定了传感器的纸上来经过分析。所述纸优选还含有预点的巧光素酶底物，从而 除了待测样品之外不需要加入其它试剂。在一个实施方式中，蜡基打印机和热原可用于在 纸上打印微流化亲水路径，通过其的流动（由毛细作用驱动）可指向具体"检测区域"。参见 Pollock等.Sci TYansl Med.2012;4(152):152ral29。还可堆叠有图案的纸的层来产生3D 装置。例如，可包括血浆分离膜和聚醋膜的层叠覆盖W保护装置免受环境的影响和限制蒸 发。层叠覆盖上的孔允许将全血或血清的指棒或吸液滴（如30ul)施加至血浆分离膜。若施 加全血，通过血浆分离膜捕获血并保持细胞，同时血浆经毛细作用进入第一层纸的个体"区 域"。在那些区域，血浆流重建干燥的试剂并产生BRET信号，其可经解释和定量。
[0056] 在一个实施方式中，传感器分子固定于固体载体。固定化可为共价或非共价，且可 用本领域已知方法实现。参见例如P. Jonkhei jm等.Angew.化em. Int .Ed. 2008,47,9618- 9647。
[0057] 在一个实施方式中，传感器通过特异配体/结合部分的对(例如生物素/链霉亲和 素)来进行非共价固定。例如，生物素部分或Str邱-标签可加入传感器分子中W允许在链霉 亲和素包被的载体(玻璃)上固定。
[0058] 本领域技术人员应理解，本发明装置高度适用于便携、"混合-和-计量"传感器，用 于精确床边药物定量，例如用于治疗药物监控、特别是用于分析复杂(生物)样品。在优选方 面，分析装置为或可为手持式，运就允许现场分析物测量。
[0059] 解育后，BRET信号可通过普通相机检测，甚至可通过手持式带相机的智能手机检 巧。。因此，本发明还提供固定或吸附于固体载体的BRET传感器分子，其中包含所述固定的传 感器分子的区域还包括巧光素酶底物。
[0060] 然而固体载体方法并不局限于本发明所述的新的改良型BRET基的传感器分子，其 还可优选用于其他定量（比率型或非比率型)BRET传感器，包括本领域已知的那些和尚未开 发的那些。
[0061] 因此本发明还设及一种使用生物发光共振能量转移(BRET)体外检测样品中感兴 趣分析物的方法，所述方法包括步骤：（a)将所述样品与BRET传感器接触，所述传感器包含 作为分开实体或单一分子的生物发光供体蛋白和巧光受体，所述接触在允许分析物诱导的 BRET变化发生的条件下进行;和(b)在至少所述服ET传感器或其生物发光供体蛋白（如巧光 素酶)组分固定于或吸附于固体载体的条件下分析能量共振转移。在一个实施方式中，固体 载体是纸并检测纸发射的光。在另一实施方式中，BRET传感器或其巧光素酶组分固定于玻 片表面或一些其他透明支持物上，并且固定的传感器接触玻片对侧的样品后通过玻片检测 BRET信号。在另一实施方式中，固体载体是透明或非透明载体，例如玻璃或塑料片，并且在 玻璃或塑料表面扩散的实验混合物发出的光从通过玻璃或塑料片的底部(在透明载体的情 况中）或从固体载体的底部或顶部(在透明载体或非透明载体的情况中）进行测量。
[0062] 如实施例6所述，检测BRET信号可通过(数字)相机方便进行，即通过获取各点的红 色和蓝色通道的平均像素强度。
[0063] 优选地，生物发光供体蛋白具有巧光素酶活性并且步骤(a)在存在合适底物时进 行，所述底物例如腔肠素、复立玛津(NanoLuc的情况中）或其衍生物。
[0064] 使用本发明的BRET传感器分子的方法中获得非常好的结果。
[0065] 样品可为生物来源或人工来源的任何样品。在一个实施方式中，其为生物样品或 其组分。例如，其为体液，优选选自：血液、血清、唾液、尿液、脊液、泪液、精液、汗液、乳液。如 上所述，本发明方法优选用于光吸收样品，尤其是吸收蓝光区域的样品，例如含血清组分的 样品。本发明方法还兼容非常低的样品体积，例如低于5微升的体积依然得到满意的分析结 果。本发明方法还优选用于感兴趣的分析物的精确定量，并且因此可产生直接的治疗行为。
[0066] 其他应用包括(现场)分析废料流或表面水质监控。例如，在一个实施方式中，所述 方法检测新鲜的海洋娱乐用水中粪便指示剂生物体。感兴趣的分析物选自所有粪便大肠菌 群的常见表面抗原，例如粪肠球菌化.faecalis)或尿肠球菌化.faecium)的核屯、脂多糖抗 原（乙醇胺、特定芙膜糖等)和甘油憐壁酸，从而可检测大肠菌群至肠球菌的广泛范围。其他 有用的应用领域包括监控作为细菌代谢物的细菌污染的指示剂或群体感应的信号分子、食 物对照的质量(例如维生素和其他营养素）、W及存在毒素化合物或污染物。
[0067] 应理解，本文所述BRET传感器具有许多实际应用，不限于基于载体的检测方法。因 此，提供用BRET体外检测样品中感兴趣分析物的方法，所述方法包括W下步骤：（a)将样品 与本发明所述的