了启动生物发光反应，在各孔加入肥阳S缓冲液(50mM肥阳S，50mM化C1，pH 7.2)中稀释50倍的50化复立玛津(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司）。各孔取化L然后点 在Whatman 1号色谱纸上（英国小查尔芬特的GE医疗公司（GE Healthcare, Little 化alfont,United Kingdom))，其用标准冲孔机生成并置于相同96-孔板的空孔中。含溶液 的孔W及含纸的孔中的生物发光在Envision多标记读数计（帕金埃尔默公司公司）上进行 测量：收集信号，用伞形酬（Umbellife;rone)发射滤器（波长：460nm，带宽：25nm)记录 NanoLuc发射和用Cy3滤器(波长:595nm，带宽：60nm)记录Cy3发射。
[0119] 图5A显示存在或不存在ΙΟμΜ胆红素的溶液中传感器对不同氨甲蝶岭浓度的响应。 显然，胆红素强烈吸收蓝光，导致NanoLuc/切3(蓝光/红光)发射强度比率的降低。由于胆红 素的浓度在人类血清样品中显著不同，传感器不能W运种方式使用来测量分析物浓度。相 反，当传感器点在纸上时，没有再观察到胆红素的影响，如图5所示。推测此现象的原因是样 品中信号的光路径显著降低。
[0120] 实施例6:用相机进行BRET检测
[0121] 为了证明使用普通数字相机检测BRET传感器的响应，选择氨甲蝶岭传感器SNAP- Pro30-NanoLuc-DHFRcpL24G5 (参见例如2)作为示例。
[0122] 如实施例2组装传感器分子。其在50化正常人血清中稀释至10化M，所述血清渗有 限定浓度的氨甲蝶岭。室溫解育溶液至少10分钟W确保传感器达到平衡。为了启动生物发 光反应，加入皿阳S缓冲液（50mM皿PES，50mM化Cl，pH7.2)中稀释50倍的50化复立玛津 (威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司）。通过在Whatman 1号色谱纸上(英国小查尔芬特的GE 医疗公司）打印96孔板形状上孔形状的圆来生产由纸制成的多孔板，主要使用前述蜡打印 机。〇11〇。4等.5(^化曰1131]^(1.2012;4(152):15化曰129)。然后扣1的各溶液点在纸上的孔 上。然后用Canon PowerSiot SX150 IS数字相机（日本东京的佳能公司（Canon,Tokyo, Japan))拍摄板的图片，所述拍摄通过厚纸板盒子中的孔进行W防止环境光干扰测量(参见 图1A)。然后通过提取红色和蓝色通道并计算平均像素强度来分析所述图片。
[0123] 6B显示所得图片，直方图显示两个孔中红色和蓝色通道中像素的强度分布。图6C 显示不同氨甲蝶岭浓度下蓝色通道的平均像素强度除W红色通道的平均像素强度的比率。 在板读数器的测量中也观察到相似结果(参见实施例2)。
[0124] 实施例7:物理固定BRET-传感器
[0125]本实施例描述能感测药物托化醋(Topamax;如实施例1所述)浓度的BRET传感器的 合成和物理固定于玻片，W提供分析装置。传感器包含人碳酸酢酶IKHCA)作为结合蛋白， 芳香横酷胺作为分子内配体。巧光素酶和TMR形成BRET对(参见图1A、B)。此外，在传感器分 子的N末端，添加用于生物素化所述传感器的AviTag肤序列（Beckett, Dorothy; Kovaleva, Elena;Schatz,Peter J.(2008)Protein Science 8(4) :921-9)。含〇6-苄基鸟嚷岭（BG)基 团用于SNAP-标签标记、巧光团四甲基若丹明（TMR)、和作为系连配体的4-(氨基甲基巧横 酷胺(氨基甲基SA)的合成调节分子根据实施例1的方案1合成。
[01 %] 融合蛋白在大肠杆菌化.col i )Rosetta-gami株系中表达并用C末端化S标签纯化。 通过用合成分子BG-TMR-氨基甲基SA标记SNAP标签来组装传感器分子(实施例1的图1B)。通 过与生物素连接酶BirA、生物素和ATP解育，用生物素标记蛋白质。生物素化的传感器分子 稀释至终浓度化g/μL。将作为薄膜的蛋白质溶液添加至包被有链霉素和素的市售可得的玻 片(Arrayit公司）。玻片于4°C和环境湿度下解育30分钟，使生物素化的传感器分子结合至 固定化的链霉亲和素。然后洗涂玻片并用市售可得的封闭缓冲液(Arrant公司）进行封闭。 然后用PBS洗涂玻片Ξ次并用0.1X PBS洗涂一次，用微阵列离屯、机旋转干燥并存于4°C。为 了评估固定化的BRET传感器对不同托化醋浓度的响应，肥PES缓冲液中含限定浓度的托化 醋和腔肠素-h(亚利桑那州派恩托普纳米光公司）的溶液点在玻片上，并用相机如实施例6 所示收集信号。
【主权项】
1. 一种用于使用生物发光共振能量转移(BRET)检测样品中感兴趣的分析物的传感器 分子，所述BRET传感器分子包括系连至合成的调节分子的蛋白质部分，其中 (i) 所述蛋白质部分包含连接至结合蛋白（BP)的荧光素酶(Luc)，所述结合蛋白（BP)能 结合所述感兴趣的分析物； (ii) 所述合成的调节分子包含能分子内结合BP的配体(L)，以及能接受存在合适Luc底 物时通过共振能量转移的来自所述Luc的能量的荧光受体，和 (i i i)其中分析物与BP的结合改变BRET传感器分子的BP和L的分子内结合的程度，从而 导致BRET效率的变化。2. 如权利要求1所述的传感器分子，其中所述合成的调节分子，优选通过天然或非天然 氨基酸或通过蛋白质标记标签，位置特异地系连至所述蛋白质部分。3. 如权利要求1所述的传感器分子，其中所述蛋白质标记标签是自标记蛋白质，例如 SNAP-标签、CLIP-标签或Halo-标签，且其中所述合成的调节分子通过合适的反应基团进行 系连。4. 如权利要求2所述的传感器分子，其中所述蛋白质标记标签是通过酶的作用进行标 记的标签，所述酶例如分选酶、硫辛酸连接酶或磷酸泛酰巯基乙胺转移酶。5. 如权利要求2所述的传感器分子，其中所述氨基酸是半胱氨酸或非天然氨基酸，所述 氨基酸允许位置特异性化学偶联反应，例如点击化学。6. 如前述权利要求中任一项所述的传感器分子，其中Luc是纳米荧光素酶(NanoLuc)。7. 如前述权利要求中任一项所述的传感器分子，其中所述感兴趣的分析物是药物、代 谢物、蛋白质、生物标记物或核酸分子。8. 如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是二氢叶酸还原酶(DHFR)或其环状排 列的变体，优选与作为分子内配体的甲氧苄啶、氨甲蝶呤或其变体组合。9. 如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是人碳酸酐酶(HCA)，优选与作为分子 内配体的4-(氨基甲基)苯磺酰胺或其变体组合。10. 如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是FK506结合蛋白（FKBP)，优选与作为 分子内配体的三甲氧基苯基脯氨酰胺N-苯甲酰苯胺或其变体组合。11. 如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是DIG10.3,优选与作为分子内配体的 孕酮或其变体组合。12. 如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是亲环蛋白A(CypA)或其环状排列的 变体，优选与作为分子内配体的5_(对-氨基苄基)_海因酸乙酯、环孢霉素 A或其变体组合。13. -种包含前述权利要求中任一项所述的BRET传感器分子的分析装置，其中所述传 感器分子以如下方式排列，当所述装置用于检测样品中感兴趣的分析物时，从所述传感器 分子发射的和由检测器收集的光子穿过所述样品的距离短于330μπι。14. 如权利要求13所述的装置，其中所述传感器分子固定于或吸附于固体载体，优选玻 璃或透明塑料。15. 如权利要求13所述的装置，其中所述传感器分子吸附于纸载体或凝胶，优选色谱纸 或滤纸。16. 如权利要求13所述的装置，其中所述传感器分子包含在薄膜中，或限制在管中、毛 细管中或(微流体)室中。17. 多组件试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-12中任一项所述的BRET传感器分子和 固体载体，优选所述固体载体是纸或透明物体，更优选色谱纸或滤纸、玻璃或透明塑料。18. 如权利要求17所述的试剂盒，还包括荧光素酶底物，优选腔肠素、复立玛津或其衍 生物。19. 一种使用生物发光共振能量转移(BRET)体外检测样品中感兴趣的分析物的方法， 所述方法包括步骤： a) 将所述样品与BRET传感器接触，所述传感器包含作为分开实体或单一分子的生物发 光供体蛋白和荧光受体，所述接触在允许分析物诱导的BRET变化发生的条件下进行;和 b) 在至少所述BRET传感器或其生物发光供体蛋白组分固定于或吸附于固体载体的条 件下分析能量共振转移。20. 如权利要求19所述的方法，其中所述BRET传感器或其生物发光供体蛋白组分固定 于或吸附于固体载体，优选所述固体载体是纸或透明物体。21. 如权利要求19或20所述的方法，其中所述生物发光供体蛋白具有荧光素酶活性且 其中步骤(a)于合适底物存在下进行，所述底物优选腔肠素、复立玛津或其衍生物。22. 如权利要求21所述的方法，其中所述BRET传感器分子是权利要求1-12中任一项所 述的传感器分子。23. -种使用生物发光共振能量转移(BRET)体外检测样品中感兴趣的分析物的方法， 所述方法包括步骤： (a) 将所述样品与权利要求1-12中任一项所述的BRET传感器分子接触，所述接触在允 许分析物诱导的BRET变化发生的条件下进行;和 (b) 分析能量共振转移。24. 如权利要求23所述的方法，其中所述步骤(b)在溶液中进行。25. 如权利要求23所述的方法，包括使用权利要求13-16中任一项所述的分析装置。26. 如权利要求19-25中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品或其部分，优选 体液，更优选选自：血液、血清、唾液、尿液、脊液、脓液、汗液、泪液、乳液。27. 如权利要求19-26中任一项所述的方法，其中所述样品吸收蓝光区域中的光。
【专利摘要】本发明涉及使用发光进行体外检测方法的领域。本发明提供用于使用生物发光共振能量转移(BRET)检测样品中感兴趣的分析物的传感器分子，所述传感器分子包括系连至合成的调节分子的蛋白质部分。本发明还提供包含传感器的分析装置和使用所述传感器分子的方法。
【IPC分类】C12Q1/66, G01N33/542
【公开号】CN105555964
【申请号】CN201380079698
【发明人】K·P·约翰森, A·思琪纳, R·格里斯
【申请人】洛桑联邦理工学院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2013年7月18日
【公告号】CA2918426A1, EP3022316A1, US20160146794, WO2015007317A1