一种放线菌及其应用_2

文档序号:9804404阅读:来源:国知局
生长形态包括气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色、色 素、产孢情况和生长状态中的至少一种;所述生理生化特性包括对碳源的利用、阿拉伯糖的 利用、海藻糖的利用、甘露糖的利用、葡萄糖的利用、木糖的利用、半乳糖的利用、肌醇的利 用、山梨糖的利用、棉籽糖的利用、鼠李糖的利用、果糖的利用、鹿糖的利用、尿素的利用、硝 酸铵的利用、甘氨酸的利用、L 一脯氨酸的利用、L 一精氨酸的利用、L 一天冬酰胺的利用和 L一天冬氨酸的利用,以及明胶液化、纤维素分解、硫化氢的产生、黑色素的产生、淀粉水解 和唯一氮源的情况中的至少一种。
【附图说明】
[0023]图1显示的是对峙培养法筛选抑制水稻稻瘟病的放线菌。
[0024]图2显示的是放线菌BS014的16rDNA构建的系统发育树。
[0025] 菌种保藏
[0026] 富阳链霉菌(Streptomyces fuyangensis)BS014菌株于2015年10月12日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No. 11482。
【具体实施方式】
[0027]高氏一号固体培养基:可溶性淀粉20.0g、NaCl 0.5g、KN03 1.0g、MgS〇47H20 0.5g、 K2HPO4 0.5g、FeS〇47H20 O.Olg、琼脂20.0g和蒸馏水lL,pH 7.4-7.6,在 121°C下灭菌20min〇
[0028] ISP2固体培养基:酵母粉4. Og、麦芽浸提粉10.0 g、葡萄糖4. Og、琼脂20.0 g和蒸馏 水lL,pH 7.2-7.4,在 121°C下灭菌20min。
[0029] ISP3固体培养基:燕麦粉20.0 g,加适量蒸馏水煮1-2h,后用纱布过滤,滤液定容至 1L,即为燕麦浸提液,每1L燕麦浸提液加微量盐溶液1.0ml,琼脂20.0g,pH 7.2,在121°C下 灭菌20min。
[0030] 微量盐溶液配方:FeS〇4 0.01%、MnCl2.4H2〇 0.01%、ZnS〇4.5H20 0.01%和蒸馏水 100ml〇
[0031] ISP4固体培养基:可溶性淀粉 10.0g、MgC03 1.0g、K2HP〇4 0.3g、NaCl 0.1g、(NH4) 2S〇42.0g、琼脂20.0g和蒸馏水lL,pH 7.2,在 121°C下灭菌20min。
[0032] I SP5 固体培养基:天冬氨酸 1 . Og、甘油 1 2 . 5g、MgS〇4 . 7H20 0 . 5 g、 CuS〇4.5H2〇0.001g、ZnS〇4.5H2〇 0.001g、MnS〇4.H2〇 0.001g、NaCl 1.0g、Fe2(S〇4) 3.6H2〇0.01g、K2HP〇4 l.Og、琼脂20.0g和蒸馏水lL,pH 7.2,在 121°C下灭菌20min。
[0033] 相对抑菌率(% )=[(对照菌落半径一处理菌落半径)/对照菌落半径。
[0034] 实施例
[0035]本发明对水稻稻瘟病菌有抑制作用的放线菌筛选方法如下:
[0036] 1、土壤样品的采集
[0037] 从云南丽江涛源山区随机采取土样。去除表面土壤,采集5-20cm深处的土样约 300g,分装标记后带回实验室。
[0038] 2、放线菌的分离和纯化
[0039] 2.1放线菌的分离
[0040]采用土壤稀释法分离,称取l〇g土壤倒入装有玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中,振荡 1 Omin,该样品作为1 0-1的稀释液;向1 0-1的稀释液中吸取10ml至新的装有90ml无菌水的三 角瓶中,振荡混匀,该样品为1〇_2的稀释液;按此方法继续稀释至1〇_ 3、1〇_4、1〇_5和1〇_6的稀 释液。吸取1〇〇μ1的10- 4、10-5和10-6的稀释液样品分别加入到高氏一号培养基平板上,涂布 均匀,倒置于28摄氏度培养箱中培养。每个样品重复2次。
[0041 ] 2.2放线菌的纯化
[0042]将平板上出现的表面干燥,与培养基结合紧密的菌落挑取做进一步的纯化。经过 分离纯化,初步得到10株放线菌,并分别为它们编号。
[0043] 3、对稻瘟病菌具有拮抗作用的放线菌的筛选
[0044] 采用平板对峙法,将稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)在PDA培养基(去皮马铃薯 20(^,葡萄糖20.0〖,琼脂20.0〖,蒸馏水11^,在121<€下灭菌20111;[11。)上活化后,用61111]1打孔器 沿着菌丝边缘打菌饼,备用。取其中一个菌饼,菌丝面朝下,接种到新的PDA培养基中央,在 离指示菌(即稻瘟病菌)等距离(2.5cm)处划线接入本发明中纯化的不同编号的放线菌(划 线长度3cm),并且每个编号的放线菌接种三个平板作为3个重复,同时以不接种放线菌只接 稻瘟病菌的平板为对照。28摄氏度进行对峙培养,5天后观察、记录。对拮抗作用显著的放线 菌进行保存。
[0045]从10株分离得到的放线菌对稻瘟病菌的平板对峙生长试验结果看,发现编号为 BS014的放线菌对稻瘟病菌的生长具有明显的拮抗作用(见图1)。测量受BS014拮抗生长的 稻瘟病菌的生长半径分别为1.2cm,1.4cm和1.2cm,对照稻瘟病菌的生长半径为2.3cm, 2.6cm和2.5cm,三次重复取平均值后根据上述公式计算得到BS014对稻瘟病菌的相对抑菌 率为48.6%。
[0046] 4、拮抗放线菌BS014对水稻立枯病菌的抑菌效果
[0047] 采用平板对峙法,将引起水稻立枯病的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum Schw.)活化后,用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼,菌丝面朝下,接种 到新的PDA培养基中央,在离指示菌(禾谷镰孢菌)等距离(2.5cm)处划线接入放线菌BS014 (划线长度3cm),并且接种三个平板作为3个重复,同时以不接种放线菌只接指示菌的平板 为对照。5天后如上述标题3中的那样观察并记录。
[0048]从10株分离得到的放线菌对水稻立枯病菌的平板对峙生长试验结果看,发现编号 为BS014的放线菌对水稻立枯病菌的生长具有明显的拮抗作用。测量受BS014拮抗生长的水 稻立枯病菌的生长半径分别为2.5cm,2.8cm和2.7cm,对照水稻立枯病菌的生长半径为 4.2cm,4.0cm和4. lcm,三次重复取平均值后根据上述公式计算得到BS014对水稻立枯病菌 的相对抑菌率为35.0%。
[0049] 5、拮抗放线菌BS014对水稻恶苗病的抑菌效果
[0050] 采用平板对峙法,将引起水稻恶苗病的串珠镰孢(Fusarium moniliforme)活化 后,用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼,菌丝面朝下,接种到新的PDA 培养基中央,在离指示菌(串珠镰孢)等距离(2.5cm)处划线接入放线菌BS014(划线长度 3cm),并且接种三个平板作为3个重复,同时以不接种放线菌只接指示菌的平板为对照。5天 后如上述标题3中的那样观察并记录。
[0051] 从10株分离得到的放线菌对水稻恶苗病的平板对峙生长试验结果看,发现编号为 BS014的放线菌对水稻恶苗病的生长具有明显的拮抗作用。测量受BS014拮抗生长的水稻恶 苗病的生长半径分别为2.4cm,2.5cm和2.4cm,对照水稻恶苗病的生长半径为3.0cm,3.2cm 和3.0cm,三次重复取平均值后根据上述公式计算得到BS014对水稻恶苗病的相对抑菌率为 20.6%〇
[0052] 6、拮抗放线菌BS014对水稻纹枯病菌的抑菌效果
[0053] 采用平板对峙法,将引起水稻纹枯病的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn) 活化后,用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼,菌丝面朝下,接种到新的 PDA培养基中央,在离指示菌(立枯丝核菌)等距离(2.5cm)处划线接入放线菌BS014(划线长 度3cm),并且接种三个平板作为3个重复,同时以不接种放线菌只接指示菌的平板为对照。5 天后如上述标题3中的那样观察并记录。
[0054]结果发现,本发明的放线菌BS014对水稻纹枯病的效果不明显。
[0055] 7、拮抗放线菌BS014对水稻稻曲病的抑菌效果
[0056]采用平板对峙法,将引起水稻稻曲病的病原菌稻绿核菌(Us tilagino idea oryzae)活化后,用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼,菌丝面朝下,接 种到新的PDA培养基中央,在离指示菌(稻绿核菌)等距离(2.5cm)处划线接入放线菌BS014 (划线长度3cm),并且接种三个平板作为3个重复,同时以不接种放线菌只接指示菌的平板 为对照。5天后如上述标题3中的那样观察并记录。
[0057]结果发现,本发明的放线菌BS014对水稻稻曲病的效果不明显。
[0058] 8、拮抗菌的鉴定
[0059] (l)16rDNA测序及序列分析
[0060] 参照Kieser et al. ,(2000)中所述方法提取放线菌BS014的基因组DNA。用细菌 16rDNA 通用弓| 物:27F : 5 ' 一agagtttgatcctggc
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