60431x，R = 0.99758。菌株NSH-D发酵液提取物 出峰时间8.803min(图1，b)，二者出峰时间接近，当向菌株NSH-D发酵液提取物中添加标准 品后HPLC出峰时间重叠，结果表明NSH-D发酵液提取液中存在石杉碱甲，发酵液中产石杉碱 甲含量为 l〇.6mg/100ml。
[0035] (四）高效表达石杉碱甲菌株分子生物学鉴定：
[0036] 1.基因组DNA提取
[0037] 1)在酒精灯火焰旁取培养基上的菌株于研鉢，液氮研磨。
[003引 2)将研磨好的菌加至1.5ml离屯、管中，标记菌株名称，加入0.6ml TE(pH 8.0)，用 枪头吸打均匀，使菌体充分悬浮。
[0039] 3)加入250μΙ 10%SDS，轻轻倒转混匀。
[0040] 4)加入化L蛋白酶K(20ngAiL)，轻轻混匀，37°C水浴化。
[0041] 5)加入 150μΙ 5mol/L NaCl，轻轻混匀。
[0042] 6)加入 150μΙ 2%CTAB，轻轻混匀，65°C水浴20min。
[0043] 7)12000巧111常溫离屯、2〇111111。
[0044] 8)小屯、吸取上清至新的1.5ml离屯、管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室溫放置 30min，12000rpm，4°C 离屯、lOmin。
[0045] 9)吸掉上清，在吸水纸上空干液体，加750μΙ 70%乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并 反复颠倒几次，12000巧m，4°C离屯、2min。
[0046] 10)每管加入30μ1纯化水溶解沉淀（水中加 Rnase，终浓度lOng/μΙ)，用手轻弹管 壁，4°C溶解过夜。
[0047] 2.DNA电泳检测
[004引 3.PCR扩增
[0049] 3.1真菌鉴定引物
[(Κ)加]18s引物序列：
[0051 ] 口SI:5 '-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '；
[0052] ITS4:5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '
[0053] 3.2PCR反应体系
[0化引 4.电泳PCR产物结果
[0化9]电泳条件:3ul样品+1 %琼脂糖凝胶，电泳方向从上往下。Marker条带组成：lOObp， 250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp，3000bp，5000bp。电泳PCR产物结果（图 2)。图中，a为菌 株检测区，b为Marker对照区，750bp条带浓度为60ng/3ul显示为加亮带，其余条带浓度均为 30ng/化1。结果：目的检测N細-D菌株DM扩增条带经琼脂糖凝胶电泳测定大小约为500- 75化P，且上下无杂带。
[0060] 5.PCR产物结果鉴定，委托北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
[0061 ] 根据blast结果，菌株NSH-D与Mucor racemosus亲源关系最近。
[0062] 本发明高效表达石杉碱真菌菌株具有下述特征：
[0063] 1.镜下形态特征
[0064] 如图3所示，该菌株菌丝有横隔，单生、直立、总状分枝抱囊梗，抱子囊球形，抱子球 形或卵圆形。
[00化]2.在真菌用PDA培养基上的特征：
[0066] 该真菌菌株在PDA培养基上生长迅速，4天后菌落平铺于整个平板，菌丝疏松呈茸 毛状，菌落PDA培养正面菌丛成黄褐色，背面成深黄褐色。
[0067] 3.该真菌菌株高效表达石杉碱甲的培养条件为：
[0068] (1)培养基：采用PDA液体培养基。具体配方为：马铃馨300g，葡萄糖20g，蒸馈水 1000ml〇
[0069] (2)培养条件:26.5°C，220r/min。
[0070] (3)装液量:250ml锥形瓶，装液量为100ml。
[0071] (4)培养时间：6天。
[0072] 本发明的NSH-D株为总状毛霉(Mucor racemosus)种、毛霉属真菌，经液体发酵培 养提取代谢产物，可获得较高产量石杉碱甲。
[0073] 本发明真菌菌株的口 S与同属的相同种的比对结果如下：
[0074] 与Mucor racemosus F13J-1 的相似度为99% ;
[00巧]与Mucor racemosus xsd08071 的相似度为99% ;
[0076] 与Mucor racemosus ATCC121 她的相似度为99%;
[0077] 与Mucor racemosus CTSP 巧的相似度为99%;
[007引 与Mucor racemosus R3的相似度为97 %。
[0079]该属鲜有报道具有产石杉碱甲能力。通过对其机理研究，可W进一步加深菌株产 石杉碱甲中高效表达基因的研究，从而构建新的转基因生物，使其获得更高效的表达。总状 毛霉(Mucor racemosus)NSH-D株作为一种新的产石杉碱甲菌株，将为生物合成途径合成石 杉碱甲提供新的菌种资源。
【主权项】
1. 一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株，其特征在于，该菌株从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属）内生真菌中分离获得，属于毛霉属、总状毛霉(Mucor racemosus) 种NSH-D株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的高效表达石杉碱甲的真菌菌株，其特征在于，该真菌菌株高效 表达石杉碱甲培养条件为： (1) 培养基:采用PDA液体培养基，具体配方为：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml; (2) 培养条件:26 · 5 °C，220r/min; (3) 装液量:250ml锥形瓶，装液量为100ml; (4) 培养时间:6天。3. 根据权利要求1所述的高效表达石杉碱甲的真菌菌株，其特征在于，该真菌菌株高效 稳定性表达石杉碱甲时，该菌株的实验室保存条件为：（1)菌株每次在TOA固体斜面传代后， 生长时间为60h; (2)保存菌种条件为4°C，12h后在将其放置-25°C冰箱中进行保存。4. 一种高效表达石杉碱甲并作为治疗阿尔茨海默病的功能菌株在生物合成制药方面 的应用。5. -种高效表达石杉碱甲的真菌菌株的应用，其特征在于，通过转基因、诱变育种对真 菌菌株进行基因改造，以获得表达效率更高、遗传稳定性更好的系列菌株。
【专利摘要】本发明公开了一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia？serrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于毛霉属总状毛霉(Mucor？racemosus)种NSH-D株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ？ID？NO：1所示。本发明高效表达石杉碱甲的真菌菌株，作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。CGMCC No.1207720160115
【IPC分类】A61P25/28, C12N1/14, A61K36/06, C12R1/785
【公开号】CN105670940
【申请号】CN201610118188
【发明人】韩文霞, 李伟泽, 韩忠文, 贾敏, 张寒, 孙静, 武永红, 周永强
【申请人】西安医学院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月2日