片全基因组DNA:
[0043] (1)取IOml 4%CTAB 60°C预热，加入2%。二硫苏糖醇DTT后混匀，
[0044] (2)称取60mg新鲜幼嫩叶片，加液氮快速研磨成粉末状，转入盛有Iml 60°C CTAB 缓冲液的2ml小离屯、管，振荡混匀，60°C水浴，55min，期间混匀4-5次，
[0045] (3)取出离屯、管冷却2min，加入1ml氯仿-异戊醇24:1，上下颠倒3-5minW充分混 匀，之后室溫下11，〇〇〇巧m离屯、5min，
[0046] (4)取离屯、液上清，转移至一新2ml离屯、管，沿管壁轻轻加入70化1氯仿-异戊醇24: 1，上下颠倒3-5min混匀，室溫下10,000巧m离屯、5min，
[0047] (5)取离屯、液上清，转移至一 1.5ml离屯、管，加 eOOiil冷藏异丙醇，-20°C下沉降 DNASOmin,
[004引 （6)室溫下10,000巧m离屯、上述离屯、管8min，弃去上清，保留白色沉淀，
[0049] (7)室溫下使用Iml 70%乙醇洗涂白色沉淀两次，10,00化pm离屯、5min，弃上清，
[(K)加](8)室溫下使用Iml无水乙醇洗涂白色沉淀两次，10，00化pm离屯、5min，弃上清， [0化1] (9)室溫下37。(：烘干15min，使无水乙醇挥发干净，
[0化2] (10)加 SOiil无菌水充分溶解，加化1 RNase，37 r消化30min即完成DNA提取；
[0053] DNA提取完成后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整程度及杂质污染 情况，然后，利用Nano化OP NDlOOO测定DNA的浓度和纯度，之后，DNA稀释至40ngAU备用；
[0054] 第2步、双酶切消化：
[0055] 利用两种限制性内切酶Avail和MspI对第一步中提取的基因组DNA进行双酶切消 化，限制性内切酶Avail识别序列如下：
[0化6] 5' -G|GWCC-3'
[0057] 3' -CCWG|G-5'
[005引限制性内切酶MspI识别序列如下：
[0059] 5' -C|CGG-3'
[0060] 3' -GGC|C-5'
[0061 ] "I"表示限制性内切酶的酶切位点，"W"代表A或T;
[0062] Avail和Mspr消化反应体系为：
[0063]
Luu〇4」 哪切化拉巧化刃：3/ 汾仙；O日U乂巧zumin;4 U保斤哪切广脚；
[00化]第3步、连接Al和A2接头：
[0066] 使用T4DNA连接酶对第二步中的限制性片段连接上DNA条形码接头Al接头和A2接 头，得到形如"Al接头-DNA插入片段-A2接头"的序列对；
[0067] 连接体系为： 「mAsl
[0069] 连接反应条件为:23°C连接化;65°C失活20min;4°C保存连接产物；
[0070] 其中Al接头条形码序列共20种，分别为：
[0071] LUU/^」 Al联头田止従和巧従姐成：
[0073] 正链：5 ' TACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXX3 '，
[0074] 负链:5 'GWCYYYYYAGATCGGAAGAGCGTCGTGTA3 ' ；
[0075] 其中：正链中的XXXXX代表DNA条形码序列，负链中YYYYY代表与DNA条形码互补序 列，W代表碱基A或T;
[0076] A2接头由正链和负链组成：
[0077] 正链：5 ' CGATAGATCGGAAGAGCCTCTTAGC3 '，
[007引 负链：5 'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAT3 ' ；
[0079] 第4步、样品混合：
[0080] 将第=步中连接好的片段的两个竹子样品按体积比6:1混合；
[0081] 第5步、目的DNA片段琼脂糖凝胶电泳回收：
[0082] 将第四步中混合产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为新配制的1XTAE， 电泳电压为4v/cm，电泳时间为90min，切割600~7(K)bp片段范围构建DNA文库；
[0083] 第6步、PCR富集目标DNA片段：
[0084] W回收的DNA片段作为模板进行PCR扩增W富集目标DNA片段，所述的PCR扩增中所 采用的引物对包括引物序列1.1和引物序列2.1，其碱基序列分别为：
[0085] 引物序列1.1:
[00化]5，AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC3，，
[0087] 引物序列2.1:
[0088] 5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC3 '；
[0089] 其中：引物序列2.1中的NNN順代表index序列，用于区分不同的个体，所述的i ndex 包括两个序列，具体为：Indexl为AACAGT，Index2为CCAGTA;
[0090] PCR扩增体系为： 「nnoi1
L 0092 J PCR反应余件为：98"C预变性3min;后进入循许程序：98"C变性20s、62"C退火30s、 72°C延伸30s，共计16个循环;72°C延伸15min，4°C保存备用；
[0093] 第7步、对上述PCR产物进行柱式纯化：
[0094] 柱式纯化使用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit所提供的离屯、柱，具体操作为：
[0095] 1、将PCR产物转移到新的1.5ml离屯、管中，加入5倍体积的Buffer CP;
[0096] 2、将上述混合液全部转移到化Bind DNA吸附柱中，10,0(K)巧m室溫离屯、Imin，弃废 液；
[0097] 3、向HiBind DNA吸附柱中加入700iU的DNA Wash Bufferao,OOOrpm室溫离屯、 Imin，弃废液，重复洗涂一次；
[0098] 4、13,000巧m室溫离屯、2min，甩干HiBind DNA吸附柱结合膜上的液体；
[0099] 5、将化Bind DNA吸附柱套入新的1.5ml离屯、管中，向化Bind DNA吸附柱的结合膜 正中央加入30]il的Elution Buffer，室溫放置Imin, 13,000巧m离屯、Imin;
[0100] 6、将离屯、管中的洗脱液重复加入化Bind DNA吸附柱的结合膜正中央，室溫放置1-2min，13，00化pm室溫离屯、2min，得到的回收产物即为待测序文库；
[0101] 第8步、片段分布检查和文库评价：
[0102] 将第7步中纯化后的文库用2%的低烙点琼脂糖凝胶进行质量检测，跑胶电压为 12〇￥，跑胶时间为9〇111111;
[0103] 第9步、如bit2.0定量并上机测序：
[0104] 将第7步中通过质量检测的文库稀释成IOnM进行测序，测序平台为I Ilumina HiSeq2000，测序长度为阳IOObp。
[0105] 本发明同时还提供了一种用于上述任一方法的SNP检测的二代测序文库构建试剂 盒，所述试剂盒由W下述部分组成：
[0106] 1)由20个序列组成的Al接头，浓度为如M，体积30iil，每对序列结构为：
[0107] 正链：5 ' TACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXX3 '，
[0108] 负链:5 'GWCYYYYYAGATCGGAAGAGCGTCGTGTA3 '，
[0109] 其中：正链中的XXXXX代表DNA条形码序列，负链中YYYYY代表与DNA条形码互补序 列，W代表碱基A或T;所述的DNA条形码由20个4-9碱基序列组成：AACAA、CCACC、TTGTT、 GGTGA、AACAGT、CCATGA、ATTGCC、TGGCTA、GAACATC、CCTAGCC、TTCGCAA、AGGTTCC、GAACATTA、 CCTAGAAT、TTCGCCTA、AGGATTCT、GAATAACAT、CCTCCTAGA、TTCTTCGCA、AGGAGGCTT;
[0110] 2)由4个序列组成的A2接头，浓度为IOiiM，体积30iU，每对序列结构为：
[0111] 正链：5 ' CGATAGATCGGAAGAGCCTCTTAGC3 '，
[0112] 负链：5'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAT3' ；
[0113] 3)10,00011/1111的限制性核酸内切酶4乂曰11、13口1及酶切缓冲液，其中4乂曰11、13口1体 积各为0.1 mL,缓冲液体积为1.25mL缓冲液成分为：50mM KAcJOmM Tri S-Ac、IOmM Mg (Ac)2、lOOiig/ml BSA，该缓冲液的PH7.9，保存溫度为-20°C ;
[0114] 4)400,000U/mL的T4DNA连接酶，其中连接缓冲液成分为:50mM Tris-肥UlOmM Mg (Cl)2、IOmM孤T，ImM ATP，该缓冲液的PH7.5,保存溫度为-20。。
[0115] 5)高保真PCR聚合酶Mix,其组分为：20units/ml Phusion DNA polymerase、0.2mM (1饥1>混合物、1乂?111131〇11〇(：缓冲液，保存溫度为-20°(：;
[0116] 6)引物序列1.1和引物序列2.1:
[0117] 引物序列1.1:
[0118] 5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC3 '；
[0119] 引物序列2.1:
[0120] 5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC3 '；
[0121] 其中：引物序列2.1中的NNN順代表index序列，用于区分不同的个体，index包括4 个序列：TTCAGT、GGAGTA、AAGCAC、CCTTCA。
[0122] 本发明首次使用了两种常见内切酶组合对目的基因组进行双酶切，扩展了酶的选 用范围，同时本发明减少了简化基因组文库构建对贵重仪器的过分依赖，简化了建库流程， 降低了建库成本并改善了测序效率。该技术操作简单灵活、检测成本低、检测通量高，更易 被科研人员掌握并能在普通的分子实验室中实现。特别适用于需要对大量个体进行SNP分 子标记开发、遗传图谱构建、群体遗传学及系统发育生物学等研究的微型或中等规模实验 室。因而MiddRAD-seq未来在农业分子育种领域，保护生物学领域及进化生物学领域都具有 良好的应用前景。
【附图说明】
[0123] 图1是双酶切简化基因组二代测序文库构建的基本操作流程图；
[0124] 图2是实施例2粉绿竹和矢竹高质量DNA电泳图；图中泳道从左到右依次为IOObp DNA分子量Marker、粉绿竹DNA-I、粉绿竹DNA-2、矢竹DNA-I、矢竹DNA-2、IOObp DNA分子量 Marker。IOObp DNA分子量Marker条带分布范围为100bp-1500bp，共11条条带，前10条为 IOObp-IOO化P，它们之间间隔为10化P，最亮的条带为50化P，第11条条带为1500bp。
[0125] 图3是实施例2粉绿竹DNA经限制性内切酶Avan和MspI酶切消化后产物的电泳图； 图中从左到右依次为IOObp DNA分子量Marker、粉绿竹DNA酶切产物、IOObp DNA分子量 Markero
[0126] 图4是实施例2两种竹子文库构建质量琼脂糖凝胶电泳检测图；图中从左到右依次 为l(K)bp DNA分子量Marker、粉绿竹简化基因组文库、矢竹简化基因组文库、IOObp DNA分子 量Marker O
[0127] 图5是实施例3测序产生的readl中碱基的质量值(如ality score)分布图；
[0128] 图6是实施例3每个样品测序产生的原始数据与高质