一种基于贵金属纳米阵列和sers技术的dna芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及生物检测、生物技术和纳米技术领域，尤其涉及一种基于贵金属 纳米阵列和SERS技术的DNA芯片。
【背景技术】
[0002] DNA芯片又称基因芯片（genechip)是生物芯片的一种，是指将大量探针分子固定 于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强 度及分布进而得到靶分子的序列和数量的信息。DNA芯片的支持物包括玻片、硅片、NC膜、 Nylon膜等。DNA芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、农作物的优育优选、司法鉴定、食 品卫生监督、环境检测等许多领域。目前DNA芯片的检测技术包括荧光、质谱以及同位素标 记，其中荧光是最主要的检测方法。但这些方法存在一些局限性，例如：荧光的光谱谱带较 宽，从而限制了对体系的多重检测；不同荧光染料需要不同波段的激发光激发，增加了检测 成本；荧光染料在激发光的激发下容易出现光漂白的现象等。
[0003] 表面增强拉曼光谱（SERS)技术是一种先进的无损检测技术，它是当分子吸附在 一些特殊金属（主要为贵金属）或半导体纳米结构表面时，其拉曼散射信号被增强多个数 量级的现象。SERS为Surface-enhanced Raman scattering的英文缩写，中文意义为表面 增强拉曼散射。它具有快速、简单、灵敏度高、指纹识别以及可重复性好的优势。SERS技术 已经得到广泛，在化学、生物和医学以及环境等领域都发挥着越来越重要的作用。相比于荧 光，SERS的具有丰富的特征拉曼光谱线，且拉曼光谱谱带窄，能够为分析物提供更加丰富的 结构信息。现在利用SERS在一些体系中甚至能达到单分子水平的检测灵敏度。但是，目 前还没有出现利用SERS技术而设计的基因芯片。 【实用新型内容】
[0004] 本实用新型的目的在于利用贵金属纳米阵列和表面增强拉曼光谱（SERS)技术而 设计一种基于贵金属纳米阵列和SERS技术的DNA芯片，实现目标DNA和基因的检测和分 析。
[0005] 本实用新型是通过以下技术方案实现的：一种基于贵金属纳米阵列和SERS技 术的DNA芯片：该DNA芯片的衬底为以贵金属纳米阵列为衬底的SERS衬底，SERS为 Surface-enhanced Raman scattering的英文缩写，中文意义为表面增强拉曼散射；在贵 金属纳米列阵上划分有若干区域，在每个区域的表面上修饰连接有不同的若干DNA探针使 DNA芯片成为含有不同探针DNA的芯片。
[0006] 作为上述方案的进一步改进，探针DNA的一端修饰巯基，通过巯基使得探针DNA与 SERS衬底结合在一起。
[0007] 作为上述方案的进一步改进，所述贵金属纳米阵列为金Au纳米阵列。
[0008] 作为上述方案的进一步改进，所述贵金属纳米阵列为银Ag纳米阵列。
[0009] 作为上述方案的进一步改进，SERS衬底还包括AA0模板，AA0是Anodic Aluminum Oxide Template的英文缩写，中文意义为阳极氧化错模板，贵金属纳米阵列设置在AAO模 板上。
[0010] 优选地，贵金属纳米阵列采用电镀或溅射的方式设置在AA0模板上。
[0011] 本实用新型利用SERS技术，设计以贵金属金（Au)或银（Ag)纳米阵列为衬底的 DNA芯片。在制作时可选取或自行制备贵金属纳米阵列，然后在纳米阵列不同区域的表面修 饰连接不同探针DNA，在使用时可根据DNA碱基互补配对的原理利用这些探针DNA对目标 DNA进行检测，再根据实际需要，进一步滴加具有特征拉曼信号的报告DNA，并根据DNA杂交 前后芯片上的SERS信号（包括频率、强度）变化、差异来实现对目标DNA的识别和定量检 测。
【附图说明】
[0012] 图1为本实用新型较佳实施例提供的DNA芯片的DNA检测原理示意图。
[0013] 图2为本实用新型较佳实施例提供的DNA芯片的制作及检测流程示意图。
[0014] 图3为图2中DNA芯片的结构示意图。
[0015] 图4为DNA芯片的锥形孔AA0模板制备流程图。
[0016] 图5为DNA芯片的具有格子状Ag纳米柱阵列的SERS衬底的制备流程示意图。
[0017] 图6为利用DNA芯片的探针DNA直接检测目标DNA时的光谱图，具体的光谱为：底 部为探针DNA的SERS光谱；顶部为探针DNA与不同浓度目标DNA杂交后的SERS光谱。
[0018] 图7为在DNA芯片上连接探针DNA的SERS衬底上滴加待测的目标DNA，然后检测 与目标DNA部分片段互补配对报告DNA的SERS信号图，SERS信号为：底部光谱为报告DNA 未经任何处理直接测试得到的SERS信号；顶部光谱为检测不同浓度下目标DNA的SERS信 号。
[0019] 图8为检测目标DNA与报告DNA混合后的SERS信号图。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本实用新型的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施实例，对 本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实 用新型，并不用于限定本实用新型。
[0021] 首先申明本发明中的DNA有三种：探针DNA、目标DNA、以及报告DNA。其中探针DNA 用来捕获目标DNA，报告DNA用来发出探测信号的。请一并参阅图1、图2、图3,本实用新型 的DNA芯片，其衬底为以贵金属纳米阵列为衬底的SERS衬底；在贵金属纳米列阵上划分有 若干区域，在每个区域的表面上修饰连接有不同的若干DNA探针，使DNA芯片成为含有不同 探针DNA的芯片（如图3所示）。利用这些DNA探针对目标DNA进行检测产生SERS信号， 根据SERS信号的频率变化、幅值差异来实现对目标DNA的识别以及定量检测（如图2所 示）。
[0022] 本实用新型的DNA芯片的基本原理如图1所示：选取或自行制备贵金属纳米阵列， 然后在纳米阵列不同区域的表面修饰连接不同探针DNA，然后根据DNA碱基互补配对的原 理利用这些探针DNA对目标DNA进行检测，再根据实际需要，进一步滴加具有特征拉曼信号 的报告DNA，并根据DNA杂交前后芯片上的SERS信号（包括频率、强度）变化、差异来实现 对目标DNA的识别和定量检测，主要指频率变化、幅值差异。
[0023] 如图2所示，本实用新型利用商业贵金属（Au或Ag)纳米阵列作为DNA芯片的 衬底，或者，可以自己利用AA0模板方法制备得到排列整齐、间距合适、SERS活性强的金 或银的贵金属纳米阵列作为DNA芯片的衬底，其中金、银纳米陈列可以通过电镀或溅射的 方法得到。在贵金属纳米列阵上划分大小合适的小区域（在图中标注为11，12，13 ;… 21，22, 23…;31，32, 33…），在每个区域上可以连接上不同的DNA探针，连接方法可以用巯基 连接的方式，从而得到适用于SERS测量的DNA芯片。
[0024] 在DNA芯片上滴加含有目标DNA的溶液，在合适的条件下（等待时间、温度等），使 不同的探针DNA与相应的目标DNA进行互补配对，然后检测杂交后的SERS信号，并分析芯 片上的DNA的SERS信号（包括频率、强度）变化、差异，初步判断检测目标DNA的情况。
[0025] 可在DNA芯片上滴加或浸泡与目标DNA某一段互补配对的报告DNA，其一端带有 容易产生SERS信号的分子基团，然后通过检测报告DNA的SERS信号，达到检测和识别目标 DNA的目的。
[0026] 本实用新型以在锥形孔AA0模板表面通过离子溅射的方法得到的Ag纳米柱阵列 为SERS衬底，制备了基于SERS技术的DNA芯片（原理性实验），具体步骤如下：
[0027] 1、表面带有纳米尖端结构锥形孔AA0模板的制备
[0028] (1)AA0模板的一次氧化：将抛光后的高纯铝片在0? 3M的草酸溶液中用40V直流 电压阳极氧化6h，然后在60°C的6wt %磷酸和1. 8wt %铬酸的混和溶液中浸泡9h，以除去 第一次阳极氧化在高纯铝片表面获得的不规则孔的氧化铝膜。
[0029] (2)表面带有尖端纳米结构的AA0模板的制备：具体的制备方法如图4所示，图4 为锥形孔AA0模板制备流程图。将步骤（1)中所得到的铝基底利用交叉氧化扩孔的方法制 备表面具有尖端纳米结构的氧化铝模板。首先把铝基底在0. 3M的草酸溶液中用40V直流 电压阳极氧化40s，接着把所得到的模板在40°C下5%的磷酸溶液中扩孔2min，重复交替上 述氧化和扩孔过程18次。
[0030] 2、划分不同区域的格子及Ag纳米柱阵列的制备
[0031] 如图5所示，图5为格子状Ag纳米柱阵列DNA芯片SERS衬底的制备流程示意图， 主要包括对1中得到的模板进行光刻处理以及离子溅射两个步骤。
[0032] (1)AA0模板的光刻处理
[0033] 将1中制备的锥形孔AA0模板置于旋涂仪上，在4000转每分钟的转速下，滴加2mL 正性光刻胶于模板上，旋涂光刻