Rna纳米颗粒及其在胃癌防治中的应用的制作方法
【专利摘要】一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA按碱基配对规则形成颗粒，a链RNA序列为SEQ ID No.1，b链RNA序列为SEQ ID No.2，以及c链RNA序列为SEQ ID No.3。本发明提供的RNA纳米颗粒经细胞和动物水平的实验验证表明其具有良好的生物安全性，优异的基因干扰效果和专一性，能够有效的抑制胃癌细胞株和皮下移植瘤的生长，可应用于胃癌防治和诊断。
【专利说明】RNA纳米颗粒及其在胃癌防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物纳米颗粒，尤其涉及一种RNA纳米颗粒，以其作为载体进行 siRNA体内和体外递送的方法，以及以近红外染料标记后的RNA纳米颗粒在皮下瘤模型中 的活体荧光成像中的应用
【背景技术】
[0002] 胃癌具有发病率高、易转移和病死率高等特点，根据临床统计，根治术后肿瘤的 复发和转移率高达33 %。在中国，胃癌发病率位于第二位，死亡率位于第三位。全球每年新 发胃癌100余万，死亡约80万，中国每年新发胃癌占全球的42%，死亡占35%，其发病率和 死亡率均是世界平均水平两倍多。
[0003] 胃癌起源于胃壁最表层的粘膜上皮细胞，可发生于胃的各个部位，可侵犯胃壁的 不同深度和广度，胃癌的早期诊断和实时追踪胃癌细胞对胃癌的治疗至关重要。手术、化 疗、放疗和生物靶向治疗是治疗恶性肿瘤的主要方法。
[0004] 中国发明专利申请201110045024. 5公开了一种胃部淋巴结清楚方法，包括先切 开肝胃韧带，清扫第12组肝十二指肠韧带淋巴结，再由幽门上方清扫第5组幽门上区淋巴 结，并切断、结扎胃右动、静脉，再沿膈肌脚、肝尾状叶下缘将小网膜内膜组织切开，沿顺时 针方向绕至贲门区右侧，清扫第1组贲门右淋巴结及第3组胃小弯淋巴结，再沿胰腺上缘处 切开胰腺被膜，至幽门下方，清扫第6组幽门下淋巴结，与幽门上区会合；再沿肝总动脉干 表面依次清扫第7组胃左动脉旁、第8组肝总动脉旁、第9组腹腔动脉旁及脾动脉干淋巴 结，从而完成淋巴结的清除。该技术首次提出了以"围歼式"的淋巴结清扫方法，并采取更 合理的清除途径，大大简化操作步骤，提高可操作性，减少清除过程对周围组织的损伤，显 著降低创面，提高作业的安全性。但是，单纯的手术治疗对于胃癌病人的疗效是有限的，晚 期病人或术后复发或转移者的主要治疗手段是化疗和放疗。
[0005] 随着胃癌分子生物学研究的不断深入，生物靶向治疗为胃癌的治疗开辟了新的途 径。RNA干扰作为目前最为有效的基因沉默技术，在肿瘤的治疗中有着重大的应用前景，其 能够特异性的阻断目标基因的表达，下调相应蛋白水平及功能，调控相关信号通路，从而抑 制肿瘤生长、侵袭，具有分子特异性和选择性，能够专一性的杀灭肿瘤细胞，而对人体的正 常组织没有损伤。然而裸露的小干扰RNA无保护，容易受机体内以及周围环境中的核酸酶 的作用而降解，稳定性低，且因小干扰RNA具有过多阴离子而导致不能自由穿透细胞膜，达 到靶组织时的剂量显著降低。因此，采用适当的递送系统将siRNA特异性的地送到靶细胞 是siRNA治疗领域的挑战。因此发展一种安全、特异性的siRNA递送体系对于胃癌的治疗 具有重大的意义。
[0006] SalihGencer等人通过lipofectamin2000作为转染试剂将针对MMP-3基因的 siRNA转入胃癌细胞株AGS中，有效的降低了AGS细胞的迁移以及浸润性（Journalof GastrointestinalandLiverDiseases. 2011Mar;20 (1):19-26)。此外，WeiZhou等人通过 慢病毒作为载体将Aktl基因的siRNA转入胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823中，体内和体 外的研究表明胃癌细胞对药物顺钼的敏感性明显增强（RegulatoryP印tides. 2012Junl0 ; 176(1-3) :13-21)。上述两项技术中涉及的siRNA递送的载体lipofectamin2000和慢病 毒在实际应用中受到lip〇fectamin2000较高的细胞毒性以及慢病毒潜在生物安全性的限 制，尚难以实现在胃癌治疗中的得以应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，生物相容性高，实现siRNA高效且 特异性的递送。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，针对BRCAAl基因的沉默可有效 抑制人胃癌细胞的增值并诱导细胞凋亡。
[0009] 本发明的再一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，将近红外染料标记的RNA纳米 颗粒作为裸鼠胃癌皮下移植瘤模型的活体荧光成像的探针。
[0010] 本发明的又一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，用于胃癌的防治。
[0011] 本发明提供的一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA按碱基配对规 则形成颗粒，其各自的序列分别为SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3,形成结构如 下式I所示
[0012]
【权利要求】
1. 一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA按碱基配对规则形成颗粒，形 成结构如下式I所示
所述的a链RNA序列为SEQ ID No. 1 ; 所述的b链RNA序列为SEQ ID No. 2 ; 所述的c链RNA序列为SEQ ID No. 3。
2. 根据权利要求1所述的RNA纳米颗粒，其特征在于所述的a链RNA的5'端标记叶 酸。
3. 根据权利要求1所述的RNA纳米颗粒，其特征在于所述的c链RNA的5'端标记示踪 剂。
4. 根据权利要求1所述的RNA纳米颗粒，其特征在于所述的b链RNA5'端携带siRNA。
5. 根据权利要求1所述的RNA纳米颗粒，其特征在于所述的b链RNA5'端携带针对 BRCAAl 基因的 siRNA。
6. 根据权利要求1所述的RNA纳米颗粒，其特征在于所述的b链RNA5'端携带针对 BRCAAl基因的siRNA，所述siRNA的包括有义链和反义链，所述的有义链与所述的b链 RNA5'端相连。
7. 根据权利要求1所述的RNA纳米颗粒，其特征在于所述的b链RNA5'端携带针对 BRCAAl基因的siRNA，所述siRNA的包括有义链和反义链，所述的有义链与所述的b链 RNA5'端相连，序列为SEQ ID No. 4,所述反义链的序列为SEQ ID No. 5。
8. 根据权利要求1所述的RNA纳米颗粒，其特征在于所述的RNA纳米颗粒的结构如下 式II所示
9. 根据权利要求1所述的RNA纳米颗粒，其特征在于所述的RNA纳米颗粒可用于生物 体成像的探针。
10. -种权利要求1所述的RNA纳米颗粒在制备治疗和预防胃癌药物中的应用。
11. 一种用于诊断或检测的组合物，其特征在于包括权利要求1-8之一所述的RNA纳米 颗粒。
【文档编号】B82Y40/00GK104327141SQ201410469956
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】崔大祥, 张春雷, 郭培宣 申请人:上海交通大学