专利名称：检测单核苷酸多态性的光纤表面等离子体波核酸传感器系统及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种将表面等离子体波共振效应与光纤技术结合在一起的新型光纤核酸传感器系统，它可应用于人类基因组研究单核苷酸多态性(SNP)。
背景技术：
表面等离子体波共振(以下简称SPR)效应是一种发生在金属与电介质界面上的物理光学现象，它对附着在金属表面电介质的折射率变化非常敏感。基于该效应的生物传感技术已广泛应用于免疫学、药物筛选等多个生化研究领域。
随着人类基因组精确序列图的完成，人类基因组研究的重点已进入后基因组时代，其主要内容之一就是建立以单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)为代表的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)序列变异的系统目录。我国正在构建和研究中华民族基因组单核苷酸多态性(SNP)系统目录。
人类基因组由30亿个单核苷酸组成。人类基因组DNA序列中最常见的变异形式就是单核苷酸多态性(以下简称SNP)，即在其DNA序列上的某些特定的位置出现不同的碱基。SNP是广泛分布于人类全基因组中稳定的多态位点，代表了不同个体之间最大的遗传差异。不同人群间的SNP等位基因频率可以有相当大的差别，某些SNP甚至还呈现群体专一性。对SNP及其突变的研究已经成为当今的生命科学领域的研究热点。
目前，应用最为广泛的研究SNP、发现突变位点的方法主要是依靠对基因的核苷酸序列测定，即测序的方法。将目标基因组用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法获得扩增产物，对产物分析测序再与公共数据库中的序列比对。测序法只能发现少量SNP，低频率的SNP往往不能发现。随着分子生物学实验技术的发展，有许多新技术应用于SNP研究。以分子杂交为基础衍生了很多相关的技术，如位点特异性探针的应用、Tagman实验、分子灯塔(molecularbeacons)技术、Minisequencing等等。但由于这些方法读需要荧光标记以及专门的分析仪器，大规模地发现和筛选SNP的可行性较差。其他一些检测SNP的方法也只能发现SNP所在的区域，但不能确定SNP的具体定位和特征。
由于SPR测定技术属于一种可以在表面上示踪生物分子特性以及相互作用的方法，具有实时、无须标记、原位跟踪动力学表面过程的能力，对样品本身无损伤等优点，并可获得许多其他方法难以获得的动力学数据。近两年来，国外有些研究组开始试图应用SPR技术来研究SNP。
美国Wilson于2002年在Science著文“Tech Sight.Analyzingbiomolecular interactions”，利用带有探针分子的SPR传感器来检测SNP。美国Oldenburg等于2002年10月在Anal Biochem(分析生物化学)发表研究报告，用SPR方法和微阵列芯片杂交技术检测人乳腺癌基因BRCA1的SNP。德国Behrensdorf等于2002年在Nucleic Acids Res(核酸研究)发表研究报告，制备DNA探针芯片，用SPR方法通过荧光标记探针的杂交成功地快速检测了p53基因(目前研究最多的肿瘤抑制基因)不同外显子的单碱基突变位点，即多态性，适合于SNP的大规模筛查。日本Nakatan等于2001年在Nat Biotechnol(自然生物技术)发表研究报告，用SPR方法检测HSP70-2基因的G-G单碱基错配。
目前国内外研究开发的大多是基于棱镜结构的SPR传感器。如1983年，瑞典LINKOPING理工学院应用物理实验室Liedberg等首先将其用于IgG与其抗原抗体之间特异性相互作用的检测，并由BIAcore公司开发出SPR传感器。此后SPR传感器的研究与改进迅速发展，SPR传感器及以BIACORE为代表的商品SPR传感器在生物医学中的应用也日益广泛。在国内，也有许多单位对棱镜表面等离子体波传感器进行研究。如中国科学院电子学研究所、长春应用化学研究所、动物研究所及清华大学等都对这种传感器在生物、化学及生化检测等方面的应用进行了研究，并取得了一定的成果。
随着研究工作的不断深入，以棱镜耦合为基础的Kretschmann模型也显现出传感部分体积较大，不适合远程遥测场合以及SPR信号易受到机械结构、光源波动等外界因素影响的缺点。为解决这些问题，1993年美国华盛顿大学R.C.Jorgenson和Yee提出将光纤纤芯作为激发SPR效应的载体，采用金作为金属膜层增覆在纤芯表面研制了光纤表面等离子体波传感器。我们在对这种新型光纤传感结构进行大量研究的基础上，采用特殊的镀膜工艺在光纤SPR探头金属薄膜表层再增覆上一层SNP特异性探针固定膜，制成光纤表面等离子体波核酸传感器。
发明内容
目前应用最为广泛的研究SNP、发现突变位点的方法主要是依靠对基因的核苷酸序列测定，即测序的方法。由于这些方法都需要荧光标记以及专门的分析仪器，大规模地发现和筛选SNP的可行性较差，并只能发现SNP所在的区域，而无法确定SNP的具体定位和特征，本发明的目的在于克服以上缺点。同时由于采用了光纤纤芯作为SPR效应的激发基体和传感部分，因此它又可避免棱镜结构的SPR传感系统显现出的传感部分体积较大，不适合远程遥测场合以及SPR信号易受到机械结构、光源波动等外界因素影响的缺点。
本发明检测单核苷酸多态性的光纤表面等离子体波核酸传感器系统包括宽带光源经P型偏振片与Y型光纤耦合器的输入端相连，Y型光纤耦合器的输出端通过耦合器接头连于传感光纤，该光纤末端可以是终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头，或者是分布式光纤表面等离子体波核酸传感器探头，Y型光纤耦合器的反射端连于与计算机相连的光谱仪。
终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头包括纤芯、位于光纤芯端面的微反射镜、光纤芯表面的金属层，涂覆在金属层表面的SNP特异性探针固定膜。
分布式光纤表面等离子体波核酸传感器的组成是在同一根光纤上可以制备多个在线反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头，该光纤的末端设置为终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头。
本发明采用相对光谱检测方法，在测量时，首先将输入光谱信号作为基准信号保存，接着将光纤表面等离子体波核酸传感器探头置于待测样本试液中，得到反射回的表面等离子体波共振光谱信号，再将该光谱信号与基准信号比较，从而获得表面等离子体波共振光谱共振波长的精确值。
本发明的有益效果是采用可以在表面上测试生物分子特性以及相互作用的SPR技术，利用SPR效应对环境介质折射率变化分辨率高、响应快、高通量、敏感、特异、简便、对样品本身无损伤等优点，并可获得许多其他方法难以获得的动力学数据；同时由于采用了光纤作为传感基体，又具有抗电磁干扰能力强、耐高压、耐腐蚀、传感探头尺寸小、可实现分布式测量以及远程遥测监控等优点；通过简化传感系统结构且采用相对光谱检测技术，可提高测量精度，克服光强测量易受光源不稳定影响的缺点。
图1是检测单核苷酸多态性的光纤表面等离子体波核酸传感器系统组成示意图。
图2是Y型光纤耦合器示意图。
图3是终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头示意图。
图4是分布式光纤表面等离子体波核酸传感器探头示意图。
图5是在线反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头示意图。
上述图中的标号名称1.宽带光源，2.P型偏振片，3.Y型光纤耦合器，4.耦合器接头，5.传感光纤，6.终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头，7.光谱仪，8.计算机，9.在线反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头，61.纤芯，62.金属层，63.微反射镜，64.SNP特异性探针固定膜，10.包层，11.涂覆层。
具体实施例方式由图1可知，本发明检测单核苷酸多态性的光纤表面等离子体波核酸传感器系统的具体组成是，宽带光源1(可采用LG150型宽带光源)经P型偏振片2，将S偏振光滤去，仅使P偏振光耦合进入Y型光纤耦合器3(如图2所示)的输入端，传播到Y型光纤耦合器3的输出端，再通过耦合器接头4，经过传感光纤5传播到终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感探头6，与待测样本中的核酸分子相互作用产生表面等离子体波共振效应，在经过探头6中的纤芯端面的微反射镜作用后形成反射光线通过Y型光纤耦合器3的反射端进入光谱仪7(可采用EPP2000型光谱仪)，再经过计算机8处理输出反射光强度与光波长之间的关系曲线，从而实现了整个测量光路部分的全光纤化。
图3是终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头示意图。它包括纤芯61、纤芯61端面的微反射镜63、纤芯61表层的金属层62以及金属层62外层的SNP特异性探针固定膜64。
在金属表层用分子自组装技术化学修饰覆盖氨丙基三乙氧基硅烷，将所设计的可检测单核苷酸多态性的特异性靶DNA探针用双功能偶联剂以共价偶联法结合到金属表层，再引入生物素一亲和素放大系统，与待测样本中的DNA分子实现互补结合。通过检测共振波长的变化情况实现对样本中DNA分子的SNP的识别与检测。
表面等变化离子共振技术可以定性的判断两分子之间是否有相互作用，比较一种分子与其他分子之间相互作用的强弱，也可以实时定量的测定分子间相互作用的亲和力参数(平衡常数)和动力学参数(速率常数)，甚至热力学参数(反应的焓)。该技术利用了物理光学的原理，在研究两分子相互作用时，将一种分子固定在SPR传感探头表面，而另一种分子的溶液流过其表面，两种分子的结合会使传感片表面的折射率改变，因此可以检测两分子间的相互作用。
图4是分布式光纤表面等离子体波核酸传感器探头示意图。它的具体组成是在同一根光纤纤芯61的不同位置涂覆一层不同类型的金属层62，在不同类型金属层62外侧再增覆一层SNP特异性探针固定膜64组成如图5所示的在线反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头9。因此在同一根光纤上可以同时设置多个在线反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头9，并将该光纤的末端加工为终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头6。
根据SPR光谱输出特性，通过在光纤纤芯的不同位置涂覆不同类型的金属层(金或银)和SNP特异探针固定膜构成可对SNP实现多位点探测的分布式光纤表面等离子体波核酸传感器。当这些SPR传感段处于不同在测试环境或介质中时，不同的待测核酸分子与特异性探针会发生不同的互补结合，从而引起各个SPR传感器附近折射率的变化，这就会在同一根光纤上多处激发表面等离子体波共振效应。通过对传感器输出SPR光谱的不同共振波长的检测，可以得到分布式检测的信号。
相对光谱检测方法当光纤SPR传感探头的结构一定时，发生表面等离子体波共振时刻的光波长即共振波长直接和金属表层环境介质的折射率相关。每次检测时，通过考察共振波长移动的情况，就能够获知被测量生物分子的情况。
光谱检测方法较光强检测方法具有更高的测量精度与分辨率，且不易受到环境因素如供电电源不稳等的影响。
在测量时，首先将输入光谱信号作为基准信号保存，接着将光纤SPR传感探头置于待测环境中，得到反射回的SPR光谱信号，再将该信号与基准信号比较，从而获得SPR光谱共振波长的精确值。
权利要求
1.一种检测单核苷酸多态性的光纤表面等离子体波核酸传感器系统，包括宽带光源(1)经P型偏振片(2)与Y型光纤耦合器(3)的输入端相连，Y型光纤耦合器的输出端(3)通过耦合器接头(4)连于传感光纤(5)，该传感光纤(5)末端可以是终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头(6)，或者是分布式光纤表面等离子体波核酸传感器探头，Y型光纤耦合器的反射端连于与计算机相连的光谱仪(7)，其特征在于所述终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头由纤芯(61)、位于纤芯(61)端面的微反射镜(63)、纤芯(61)表层的金属层(62)以及金属层(62)外侧的SNP特异性探针固定膜(64)所组成；所述分布式光纤表面等离子体波核酸传感器探头的具体组成是，在同一根光纤纤芯(61)上可以制备多个在线反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头(9)，该光纤的末端设置为终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头(6)。
2.一种检测单核苷酸多态性的光纤表面等离子体波核酸传感器系统的检测分析方法，其特征在于采用相对光谱检测方法，即在测量时，首先将输入光谱信号作为基准信号保存，接着将光纤表面等离子体波核酸传感器置于待测样本试液中，得到反射回的表面等离子体波共振光谱信号，再将该光谱信号与基准信号比较，从而获得表面等离子体波光谱共振波长的精确值。
全文摘要
一种涉及检测单核苷酸多态性的光纤表面等离子体波核酸传感器系统及检测方法。其系统包括宽带光源(1)、P型偏振片(2)、Y型光纤耦合器(3)、耦合器接头(4)、传感光纤(5)、终端反射式光纤表面等离子体波共振生物传感器探头(6)、光谱仪(7)以及计算机(8)组成。本发明中采用终端反射式光纤表面等离子体波核酸传感器探头和分布式光纤表面等离子体波核酸传感器探头实现单核苷酸多态性检测。本传感器系统采用相对光谱检测方法，获得表面等离子体波共振光谱共振波长的精确值。本发明具有无须标记、对样品本身无损伤等优点，并可获得动力学数据，可克服现有技术中光强测量易受光源和机械结构波动影响的缺点。
文档编号G01N21/25GK1598538SQ20041004152
公开日2005年3月23日 申请日期2004年7月28日 优先权日2004年7月28日
发明者梁大开, 齐名, 曾捷, 崔英霞, 汤林, 虞伟 申请人:南京航空航天大学