专利名称：一种异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种异丙隆的分析方法及其试剂盒，更具体地说涉及一种异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法及其试剂盒。主要应用于土壤、水、植物、粮食中残留异丙隆的快速检测，也可用于农药原药和制剂中异丙隆的快速鉴定。
背景技术：
异丙隆(Isoproturon)化学名称为3-(4-异丙基苯基)-1，1-二甲基脲，英文化学名称为3-(4-isopropylphenyl)-1，1-dimethylurea，CAS登录号为[34123-59-6]。
异丙隆是由Ciba-Geigy公司(现Syngenta公司)研制，德国赫斯特公司(现安万特公司)开发的脲类除草剂。目前世界上至少有10家公司生产该品种。国内由沈阳化工研究院于1973年研制成功。
异丙隆主要用于小麦、玉米、花生、棉花等农田防除禾本科杂草及大多数阔叶杂草，防除效果好，毒性低。由于异丙隆广泛地应用于农业生产上，在环境中的残留问题也日趋严重，对人们的健康构成了潜在的威胁。目前，欧盟已经限制使用异丙隆。因此，加强水、土壤和粮食中残留异丙隆的监测，对科学合理地使用异丙隆，保障农作物的安全生产和农业的丰收具有重要意义。随着人们对异丙隆的毒性与环境风险的日益关注，急需更科学、快捷和高效的检测手段。
目前已报道的残留异丙隆的检测方法有衍生化气相色谱法和高效液相色谱法等。理化测定需要昂贵的仪器设备、专业化的实验室和训练有素的专门人才，衍生和固相萃取等样品前处理过程复杂，速度慢，选择性差，微量的目标分析物难以检出。因此，需要研究开发可以适应大批量样本快速检测、特异性强的、灵敏度高的残留异丙隆检测新技术。
发明内容
本发明解决了上述现有技术中存在的问题和不足，提供了一种特异性强、灵敏度高、廉价高效、适合环境和生物样本中残留异丙隆快速检测的直接竞争酶联免疫吸附分析方法。
本发明同时还提供了一种特异性强、灵敏度高、廉价高效、适合环境和生物样本中残留异丙隆现场快速检测的酶联免疫吸附分析试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其包含以下步骤
1)以1-(5一戊基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲和1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲为半抗原，与不同蛋白质共价偶联合成人工抗原和包被原；2)以人工抗原免疫动物获得对异丙隆具有特异性亲合力的抗体；3)加入酶标记半抗原和抗体；4)用包被原或抗体包被聚苯乙烯微孔板，加入待测样品或异丙隆标样与酶标记物的混合液进行竞争性免疫结合反应；5)洗涤去除游离物，加入酶的底物和显色剂，终止反应后即可得到待测样品中的异丙隆含量。
本发明中异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其所述的异丙隆半抗原1-(5-戊基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲是以N-甲基己内酰胺为起始原料，水解制得中间产物N-甲基己酸，再与对异丙基苯异氰酸酯反应合成的，分子结构式为 其中n＝5；所述的异丙隆半抗原1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲是以N-甲基吡咯环酮为起始原料，水解制得中间产物N-甲基丁酸，再与对异丙基苯异氰酸酯反应合成的，其分子结构式为 其中n＝3。
本发明的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其所述的人工抗原与包被原是采用活性酯法或混合酸酐法将所述半抗原与不同蛋白质共价偶联而成；所述的蛋白质选自牛血清白蛋白和卵清蛋白；所述的抗体为人工抗原与弗氏佐剂混合乳化后免疫兔、羊或鼠制备的对异丙隆具有特异性亲合力的多克隆抗体或采用杂交瘤技术制备的对异丙隆具有特异性亲合力的单克隆抗体；所述步骤3)使用的是辣根过氧化物酶标记半抗原和抗体，从而得到酶标半抗原和酶标记抗体；所述酶标半抗原是采用混合酸酐法或活性酯法将所述半抗原与辣根过氧化物共价偶联而成；所述酶标记抗体是采用过碘酸盐法将辣根过氧化物酶与所述抗体共价偶联而成。
本发明的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法中，所述的用包被原或抗体包被聚苯乙烯微孔板是以卵清蛋白、脱脂奶粉或明胶封闭微孔表面未吸附包被原或抗体的位点；所述酶的底物为过氧化脲或过氧化氢；所述显色剂为3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺或邻苯二胺。本发明的用于异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法的试剂盒，包括盒体和置于盒体内的可拆卸式聚苯乙烯微孔板，其特征在于还包括包被原或对异丙隆具特异性亲合力的抗体其中包被原为1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲与蛋白质共价偶联合成的、对异丙隆具特异性亲合力的抗体为人工抗原与适量弗氏佐剂混合乳化后免动物制备的对异丙隆具有特异性亲合力的多克隆抗体或采用杂交瘤技术制备的对异丙隆具有特异性亲合力的单克隆抗体；碳酸盐缓冲液0.1mol/L碳酸钠溶液150mL与0.1mol/L碳酸氢钠溶液350mL混匀，加2gNaN3溶解，定容至1000mL制成；磷酸盐缓冲液2gNaN3溶于280mL 0.2mol/L NaH2PO4与720mL 0.2mol/L Na2HPO4的混合液；封闭液5.0g明胶、0.5gNaN3溶于0.01mol/L、pH7.2的碳酸盐缓冲液并定容至1000mL，4℃保存；异丙隆标样异丙隆标样0.0100g，溶于100mL甲醇，4℃保存；酶标半抗原采用混合酸酐法或活性酯法将异丙隆半抗原与辣根过氧化酶共价偶联，透析去除游离的小分子化合物后保存于50％甘油中，4℃以下保存；酶标抗体采用改良的过碘酸盐法将辣根过氧化物酶与对异丙隆具特异性亲合力的抗体共价偶联，层析纯化后保存于50％的甘油中，4℃以下保存；底物液0.6g过氧化脲溶于1000mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液，4℃保存，所含底物可被标记的酶催化成有色产物，其中所述的1000mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液为5.2g柠檬酸、18.4g磷酸氢二钠溶于蒸馏水并定容至1000mL；显色剂0.44gTMB溶于3.2mL无水乙醇，用柠檬酸-磷酸盐缓冲液定容至1000mL，充N2或减压脱气，4℃保存，其中所述的柠檬酸-磷酸盐缓冲液为5.2g柠檬酸、18.4g磷酸氢二钠溶于蒸馏水并定容至1000mL；终止液100mL浓硫酸在搅拌下慢慢加入800mL蒸馏水中，冷却，用于终止酶催化反应。
本发明的有益效果是本发明检测方法及其试剂盒科学性强、技术先进、应用方法简单。本发明的基本依据是小分子化合物免疫分析化学原理和技术。分子量小于5000道尔顿的化合物一般不具备免疫原性，将异丙隆分子特异性部分以半抗原的形式与不同蛋白质共价偶联制备人工抗原和包被原，以人工抗原免疫动物产生对异丙隆具特异性亲合力的抗体。小分子化合物虽然不具备免疫原性但具有反应原性，能与对应抗体在离体条件下发生免疫结合反应并符合质量作用定律。以辣根过氧化物酶标记对异丙隆具特异性亲合力的抗体和异丙隆半抗原，用包被原或对异丙隆具特异性亲合力的抗体包被聚苯乙烯微孔板，加入待测样品(或异丙隆标样)与酶标记物的混合液，异丙隆、酶标记物与包被在微孔表面的包被原或抗体发生竞争性免疫结合反应，洗涤去除未结合的游离物，加入酶的底物和显色剂，酶促显色反应的强度与结合在包被原或抗体上的酶标记物的量成正比，与样品(或标样)中异丙隆的含量成反比，据此建立异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法。运用该方法，在盒内设置相关试剂与材料，制备异丙隆免疫检测试剂盒，适合环境和生物样本中残留异丙隆的现场快速检测。试剂盒对异丙隆检测的线性浓度范围是10-2～101μg/mL，检测限2ng/mL。通过参看说明书，专业人员可以现场检测操作，一般工作人员也可以进行现场检测分析，便于推广使用。
具体实施例方式
实施例11)以N-甲基己内酰胺为起始原料，水解制得中间产物N-甲基己酸，再与对异丙基苯异氰酸酯反应合成半抗原1-(5-戊基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲(HAP4C)，具体步骤为在250mL烧瓶中加入110mL蒸馏水，10mL N-甲基吡咯烷酮，22.8g八水合氢氧化钡。加热回流3h，控制回流温度为106℃。反应结束后，把反应液置锥形瓶中，用冰水冷却。氢氧化钡晶体析出后过滤。20mL冰水洗涤氢氧化钡固体，合并洗液与滤液。向滤液中通入二氧化碳，至pH为6，过滤收集滤液，蒸馏除水得N-甲基丁酸粗品。用无水乙醇/乙醚(体积比1∶1)重结晶两次得白色结晶状固体5.0g，收率42％。熔点151-153℃。
取0.90g对异丙基苯基异氰酸酯，0.91g N-甲基丁酸及10.5mL 1mol/L氢氧化钠，混合，在室温下搅拌2h，过滤后，在滤液中滴加浓盐酸直至pH值为2。溶液呈乳白色。静置过夜，待有固体粗品析出后，用乙醇/水(体积比1∶2)重结晶两次，得白色片状晶体1.3g，熔点134-136℃。化学结构用薄层色谱、红外和核磁鉴定。
产物HAP4C的鉴定取上述合成的产物分别经薄层色谱、红外光谱和核磁共振鉴定结构。在薄层色谱板上只有一个斑点(紫外灯，254nm)，比移值Rf＝0.23。红外光谱(KBr压片)谱图解析3341cm-1(s，NH)，1715cm-1(vs，COOH)，1636cm-1(vs，amide C＝O)，1537cm-1(vs，amide II)，1231cm-1(m，C-O)。核磁共振(1HNMR，DMSO-d6)谱图解析δ12.1(1H，OH)，8.1(s，1H，NH)，7.34(d，2H，ArH-2，6)，7.08(d，2H，ArH-3，5)，3.29(t，2H，CH2-4)，2.91(s，3H，NCH3)，2.81(heptet，1H，CH)，2.22(t，CH2-2)，1.72(2H，CH2-3)，1.17(d，6H，2CH3)。
以N-甲基吡咯环酮为起始原料，水解制得中间产物N-甲基丁酸，再与对异丙基苯异氰酸酯反应合成半抗原1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲(HAP6C)，具体为在250mL烧瓶中加入117mL水，13g浓硫酸和13gN-甲基己内酰胺，加热回流10h。趁热向溶液中加入氢氧化钡，搅拌，直到pH值达到10。静置24h后过滤除去大部份白色硫酸钡沉淀。用20mL水清洗白色沉淀，合并洗液与滤液。向滤液中通入二氧化碳，至pH为6。过滤收集滤液，蒸馏滤液得到黄色油状物，静置，析出粗品。用无水乙醇/乙醚(体积比1∶1)重结晶两次得白色结晶状固体8.0g，收率52％。熔点66-68℃。
取0.36g对异丙基苯基异氰酸酯，0.36g N-甲基己酸(二水合物)及4.2mL 1mol/L氢氧化钠，混合，在室温下搅拌2h，过滤后，在滤液中滴加浓盐酸使pH为2。静置过夜，待有固体粗品析出后，用乙醇/水(体积比1∶2)重结晶两次，得白色片状晶体0.60g，熔点95-96℃。化学结构用薄层色谱、红外和核磁鉴定。
产物HAP6C的鉴定产物在薄层色谱板上只有一个斑点(紫外灯，254nm)，比移值Rf＝0.33。红外光谱(KBr压片)谱图解析3378cm-1(s，NH)，1715cm-1(vs，COOH)，1646cm-1(vs，amide C＝O)，1525cm-1(vs，amide II)，1243cm-1(m，C-O)。核磁共振(1HNMR，DMSO-d3)谱图解析δ12.0(1H，OH)，8.08(s，1H，NH)，7.32(d，2H，ArH-a，b)，7.05(d，2H，ArH-c，d)，3.25(t，2H，CH2-6)，2.89(s，3H，NCH3)，2.79(heptet，1H，CH)，2.18(t，CH2-2)，1.5(m，4H，CH2-3，5)，1.25(m，2H，CH2-4)，1.15(d，6H，2CH3)。
2)将半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白共价偶联合成人工抗原和包被原；人工抗原的合成免疫原的制备免疫原的合成用碳二亚胺法。将0.2mmol半抗原(HAP6C)，溶解在1mL的DMF中，然后在该溶液中加入等摩尔的DCC和NHS，室温下反应4h，继续在4℃下反应12h。然后离心(6min，1400r/min)，除去脲沉淀，取上清液800μL至BSA溶液(在4℃下搅拌16h)。装入透析袋，于0.2mol/L PBS(含0.9％(w/v)NaCl)溶液中透析4天。透析后的溶液用紫外扫描计算结合比。最后分装保存于-20℃的冰箱中。
人工抗原结合比测定采用紫外可见分光光度计对半抗原、偶联物及蛋白进行紫外全波长扫描。HAP6C-BSA偶合物的紫外吸收图谱与BSA、Hapten6C相比，吸收曲线发生了改变，HAPC-BSA偶合物在HAP6C的最大吸收波长245nm处吸光值有所增加，表明免疫半抗原与蛋白的偶联是成功的。经计算人工抗原结合比为46∶1。
3)人工抗原与弗氏佐剂混合乳化后免疫兔制备对异丙隆具有特异性亲合力的多克隆抗体；抗体的制备①免疫兔子制备抗血清以HAP6C-BSA作为免疫原，选取三只1.2、1.4和1.5kg的纯种新西兰大白兔作为试验动物，试验前一周采集阴性血清(1mL/只)做阴性对照。具体免疫程序如下首免采用每只1mg免疫原与等体积弗氏完全佐剂混和，乳化成油包水结构后进行背部皮下多点注射(40点左右)。三周后用同样剂量的免疫原与等体积不完全弗氏佐剂进行加强。此后每隔两周加强一次。从第二次加强开始，每次加强后第7天，从兔子耳缘静脉采血，测定效价。待免疫血清效价上去以后，就可以进行采血。本实验采用心脏采血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，先待收集在三角烧瓶中的血液凝固后，用接种针沿三角烧瓶边缘将血块与玻璃脱离，放置于37℃温箱中0.5h，再放到4℃冰箱中3h，待血块收缩后，用毛细管将血清吸入试管中，以3000rpm离心15min，分离出血清。在血清中添加终浓度为0.02％(W/V)的叠氮钠，分装后于-20℃冻存。
抗血清效价测定用免疫原免疫三只兔子。从第二次加强免疫开始，每次加强后第7天，从兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第四次加强免疫后，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价分别为1.6×105、8.0×104、2×104(指OD450nm值大于1.0)。
②抗体的纯化和鉴定采用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体取30mL抗血清与等体积的PBS混合，搅拌下逐滴加入10mL饱和硫酸铵，4℃过夜，使免疫球蛋白充分沉淀。3000g离心20min，弃去上清液。用10mLPBS溶解沉淀，再逐滴加入5mL饱和硫酸铵溶液，4℃过夜。重复上述过程1次。用10mLPBS溶解沉淀物装入透析袋。4℃透析三天充分除盐(每天换液4次)。蛋白质冷冻干燥后于-20℃保存。
注意事项提取免疫球蛋白时，最好在2-4℃条件下进行，假如时间不长，也可在室温下进行，全部材料使用前均应冷却。
③抗体的特异性用具有多种抗原决定簇的免疫原(蛋白质或多肽)制备的抗血清，其中含的分子往往是混合体。当有甲、乙两种抗原，其分子结构中具有相同或部分相同的抗原决定簇时，甲抗原可以与乙抗原的抗血清反应，而乙抗原可以与甲抗原的抗血清反应，称为交叉反应。抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性越好。
将特异性抗原及其类似物作系列稀释，分别与同一种抗血清，按制作标准曲线同样方法制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的剂量和类似物抑制率50％的用量，然后计算出各类似物的交叉反应率。
经测定与异丙隆结构相似的氯溴隆、氟草隆、绿谷隆的交叉反应率分别为0.16％、0.35％、0.51％，与丁噻隆、噻苯隆和环草隆的交叉反应率都小于0.01％。由于半抗原HAP6C与蛋白质结合的位点能够很好地突出农药的活性位置，从而抗HAP6C-BSA抗体对各农药类似物的交叉反应均较小，所制备的抗体的特异性较强。
4)采用活性酯法将半抗原与辣根过氧化物酶共价偶联制备酶标半抗原，采用过碘酸盐法将辣根过氧化物酶与抗体共价偶联制备酶标抗体；5)再用包被原包被聚苯乙烯微孔板，以明胶封闭微孔板表面未吸附包被原位点；6)在包被好包被原的微孔板的孔中加入异丙隆标样与酶标记物的混合液，异丙隆、酶标记物与包被在微孔表面的包被原发生竞争性免疫结合反应，洗涤去除未结合的游离物；7)加入酶的底物过氧化脲和显色剂TMB的混合液，在水平振摇器上振摇1分钟，显色20分钟后终止，酶促显色反应的强度与结合在包被原上的酶标抗体或结合在抗体上的酶标半抗原的量成正比，与样品(或标样)中异丙隆的含量成反比。
实施例2 异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析试剂盒2.1微孔板的包被将包被原用碳酸盐缓冲液稀释成适当浓度或将抗体用磷酸盐缓冲液溶解成适当浓度，加入微孔板的孔中，100μL/孔，4℃吸附过夜。去除孔中的溶液，拍干，加入封闭液，150μL/孔，4℃封闭过夜或37℃封闭2小时，去除多余的封闭液，拍干，用磷酸盐缓冲液洗3次，拍干，4℃条件下自然干燥，加干燥剂密封包装，4℃以下保存备用。也可将包被原或抗体、缓冲液、封闭液分别装入指定容器，置试剂盒内，由用户在使用前按使用说明自行包被。
2.2碳酸盐缓冲液的配制0.1mol/L碳酸钠溶液150mL与0.1mol/L碳酸氢钠溶液350mL混匀，加2gNaN3溶解，定容至1000mL。
2.3异丙隆标样溶液的配制准确称取异丙隆标样0.0100g，溶于100mL甲醇，4℃保存。
2.4酶标半抗原的制备采用混合酸酐法或活性酯法将异丙隆半抗原与辣根过氧化酶共价偶联，透析去除游离的小分子化合物后保存于50％甘油中，包被抗体直接结合法测定酶标半抗原效价，制备试剂盒时将酶标半抗原用50％甘油稀释至使用浓度的100倍，4℃以下保存。
2.5酶标抗体的制备采用改良的过碘酸盐法将辣根过氧化物酶与对异丙隆具特异性亲合力的抗体共价偶联，Sephadex G200柱层析纯化后保存于50％的甘油中，包被原包被直接结合法测定酶标抗体效价，制备试剂盒时将酶标抗体用50％甘油稀释至使用浓度的100倍，4℃以下保存。
2.6碳酸盐缓冲液的配制2gNaN3溶于280mL 0.2mol/L NaH2PO4与720mL 0.2mol/L Na2HPO4的混合液。
2.7封闭液的配制5.0g明胶、0.5gNaN3溶于0.01mol/L、pH7.2的碳酸盐缓冲液并定容至1000mL，4℃保存。
2.8底物液的配制0.6g过氧化脲溶于1000mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(5.2g柠檬酸、18.4g磷酸氢二钠溶于蒸馏水并定容至1000mL)，4℃保存。
2.9显色剂的配制0.44gTMB溶于3.2mL无水乙醇，用柠檬酸-磷酸盐缓冲液定容至1000mL，充N2或减压脱气，4℃保存。
2.10终止液的配制100mL浓硫酸在搅拌下慢慢加入800mL蒸馏水中，冷却。
2.11试剂分装各种试剂按要求配制，测定合格后无菌分装。包被原(或对异丙隆具特异性亲合力的抗体)适量/瓶、异丙隆标样0.1mL/瓶、酶标抗体0.1mL/瓶、酶标半抗原0.1mL/瓶、碳酸盐缓冲液12mL/瓶、封闭液16mL/瓶、磷酸缓冲液10mL/瓶、底物液6mL/瓶、显色剂6mL/瓶、终止液6mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃存放。
2.12试剂盒组装分别将可拆卸式微孔板1块，包被原或对异丙隆具特异性亲合力的抗体、异丙隆标样溶液、酶标抗体或酶标半抗原、碳酸盐缓冲液、封闭液、磷酸盐缓冲液(也可事先将包被原或抗体包被在微孔板上并封闭，置试剂盒内指定位置)、底物液、显色剂、终止液各1瓶，使用说明书1份置试剂盒内指定位置。试剂盒检验合格后封装，4℃保存。
权利要求
1.一种异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于包含以下步骤1)以1-(5-戊基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲和1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲为半抗原，与不同蛋白质共价偶联合成人工抗原和包被原；2)以人工抗原免疫动物获得对异丙隆具有特异性亲合力的抗体；3)加入酶标记半抗原和抗体；4)用包被原或抗体包被聚苯乙烯微孔板，加入待测样品或异丙隆标样与酶标记物的混合液进行竞争性免疫结合反应；5)洗涤去除游离物，加入酶的底物和显色剂，终止反应后即可得到待测样品中的异丙隆含量。
2.根据权利要求1所述的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于所述的异丙隆半抗原1-(5-戊基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲是以N-甲基己内酰胺为起始原料，水解制得中间产物N-甲基己酸，再与对异丙基苯异氰酸酯反应合成的，分子结构式为 其中n＝5；所述的异丙隆半抗原1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲是以N-甲基吡咯环酮为起始原料，水解制得中间产物N-甲基丁酸，再与对异丙基苯异氰酸酯反应合成的，其分子结构式为 其中n＝3。
3.根据权利要求1所述的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于所述的人工抗原与包被原是采用活性酯法或混合酸酐法将所述半抗原与不同蛋白质共价偶联而成。
4.根据权利要求1或3所述的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于所述的蛋白质选自牛血清白蛋白和卵清蛋白。
5.根据权利要求1所述的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于所述的抗体为人工抗原与弗氏佐剂混合乳化后免疫兔、羊或鼠制备的对异丙隆具有特异性亲合力的多克隆抗体或采用杂交瘤技术制备的对异丙隆具有特异性亲合力的单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于所述步骤3)使用的是辣根过氧化物酶标记半抗原和抗体，从而得到酶标半抗原和酶标记抗体。
7.根据权利要求6所述的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于所述酶标半抗原是采用混合酸酐法或活性酯法将所述半抗原与辣根过氧化物共价偶联而成；所述酶标记抗体是采用过碘酸盐法将辣根过氧化物酶与所述抗体共价偶联而成。
8.根据权利要求1所述的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于所述的用包被原或抗体包被聚苯乙烯微孔板是以卵清蛋白、脱脂奶粉或明胶封闭微孔表面未吸附包被原或抗体的位点。
9.根据权利要求1所述的异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法，其特征在于所述酶的底物为过氧化脲或过氧化氢；所述显色剂为3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺或邻苯二胺。
10.一种用于异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法的试剂盒，包括盒体和置于盒体内的可拆卸式聚苯乙烯微孔板，其特征在于还包括包被原或对异丙隆具特异性亲合力的抗体其中包被原为1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲与蛋白质共价偶联合成的、对异丙隆具特异性亲合力的抗体为人工抗原与适量弗氏佐剂混合乳化后免动物制备的对异丙隆具有特异性亲合力的多克隆抗体或采用杂交瘤技术制备的对异丙隆具有特异性亲合力的单克隆抗体；碳酸盐缓冲液0.1mol/L碳酸钠溶液150mL与0.1mol/L碳酸氢钠溶液350mL混匀，加2gNaN3溶解，定容至1000mL制成；磷酸盐缓冲液2gNaN3溶于280mL 0.2mol/L NaH2PO4与720mL 0.2mol/L Na2HPO4的混合液；封闭液5.0g明胶、0.5gNaN3溶于0.01mol/L、pH7.2的碳酸盐缓冲液并定容至1000mL，4℃保存；异丙隆标样异丙隆标样0.0100g，溶于100mL甲醇，4℃保存；酶标半抗原采用混合酸酐法或活性酯法将异丙隆半抗原与辣根过氧化酶共价偶联，透析去除游离的小分子化合物后保存于50％甘油中，4℃以下保存；酶标抗体采用改良的过碘酸盐法将辣根过氧化物酶与对异丙隆具特异性亲合力的抗体共价偶联，层析纯化后保存于50％的甘油中，4℃以下保存；底物液0.6g过氧化脲溶于1000mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液，4℃保存，所含底物可被标记的酶催化成有色产物，其中所述的1000mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液为5.2g柠檬酸、18.4g磷酸氢二钠溶于蒸馏水并定容至1000mL；显色剂0.44gTMB溶于3.2mL无水乙醇，用柠檬酸-磷酸盐缓冲液定容至1000mL，充N2或减压脱气，4℃保存，其中所述的柠檬酸-磷酸盐缓冲液为5.2g柠檬酸、18.4g磷酸氢二钠溶于蒸馏水并定容至1000mL；终止液100mL浓硫酸在搅拌下慢慢加入800mL蒸馏水中，冷却，用于终止酶催化反应。
全文摘要
本发明公开了一种异丙隆直接竞争酶联免疫吸附分析方法及其试剂盒，本发明分析方法及其试剂盒科学性强、技术先进、应用方法简单。本发明的方法包括以下步骤(1)以1－(5－戊基羧基)－3－(4－异丙基苯基)－1－甲基脲和1－(3－丙基羧基)－3－(4－异丙基苯基)－1－甲基脲为半抗原，与不同蛋白质共价偶联合成人工抗原和包被原；2)以人工抗原免疫动物获得对异丙隆具有特异性亲合力的抗体；3)加入酶标记半抗原和抗体；4)用包被原或抗体包被聚苯乙烯微孔板，加入待测样品或异丙隆标样与酶标记物的混合液进行竞争性免疫结合反应；5)洗涤去除游离物，加入酶的底物和显色剂，终止反应后即可得到待测样品中的异丙隆含量。
文档编号G01N33/577GK1971277SQ20061009823
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月6日 优先权日2006年12月6日
发明者李方实, 孙峰 申请人:南京工业大学