专利名称：用于中国汉族人白癜风相关性的单核苷酸多态性的检测方法
技术领域：
本发明涉及用于中国汉族人白癜风相关性的X盒结合蛋白1单核苷酸多态性的检测方法。
技术背景白癜风(vitiligo)是由遗传因子和环境因素共同作用的多基因疾病，被列为世界皮 肤科三大疑难顽症之一。该病一般人群中患病率大约为0.5%~1%,困扰着全世界约5000 万以上患者，该病是一种由于皮肤黑素细胞减少或缺失而引起的后天性色素脱失性皮肤 病。中国人群患病率为0.1% 2%，大约有1200多万患者。皮损表现为数目不等、大小 不一、形状不定的色素脱失斑，有的开始为色素减退斑，边界不清，以后渐发展成为乳 白色的色素脱失斑，白斑境界清楚，有的边缘部色素反而增加。由于该病病因不明、发病机制复杂及种族和个体差异，目前尚无十分有效的根治方 案。虽不痛不痒，但发无定处，好发于颜面等暴露部位，所及之处皮肤色素完全脱失而 呈瓷白色，严重影响自身形象美观，甚至毁损患者容貌，常遭非议和歧视，造成学习、 交友、就业、婚姻等方面难以逾越的障碍，给患者带来巨大精神痛苦；泛发型白癜风可 累及全身50%以上体表面积，常伴有毛发变白，导致皮肤排汗不畅，皮肤细胞代谢紊乱， 有可能诱发其它自身免疫性疾病，给患者身体健康带来严重影响。目前，欧美国家多个 研究小组对白癜风的遗传学开展国际合作研究，试图通过资源整合推动研究进程，尽快 发现白癜风的易感基因，占据白癜风领域的基因专利和药物开发市场。中华民族系黄色 人种，皮肤色素较深，白癜风皮损非常醒目，严重影响患者身心健康。因此，我们必须 充分收集、保护和利用我国丰富的遗传资源，积极参与国际竞争，从分子生物学的角度 对白癜风进行深入研究，为中华民族和全人类造福。国内外研究均表明遗传因素在白癜风的发病中起重要作用。通过美国全文数据库 (PubMed)和中国生物医学文献数据库(CBM)检索，国际上对白癜风的遗传学研究 的文章不到200篇(153篇)，主要集中在易感基因定位、人类白细胞抗原(HLA)等位 基因相关性研究及候选基因研究等三个方面。 易感基因定位国际上对于白癜风易感基因定位研究起步较晚，这可能与国外白癜 风不易引起重视及缺乏遗传资源有关，迄今为止已发现了 5个白癜风易感基因位点。国 外对白癜风易感基因的全基因组扫描定位研究始于2001年，通过国际合作整合资源， 应用遗传连锁分析原理，通过全基因组扫描共发现了欧美白种人的5个白癜风易感基因 位点，分别命名为白癜风相关的多种自身免疫性疾病易感位点1 (VAMAS1) (17pl3)， 自身免疫性疾病易感位点l(AISl) (Ip31.2-p32.3)，自身免疫性疾病易感位点2(AIS2) (Chr.7)，自身免疫性疾病易感位点3(AIS3)(Chr.8)及自身免疫性疾病易感位点4(AIS4) (Chr.4)。人类白细胞抗原(HLA)等位基因相关性研究HLA复合体是迄今发现的基因密 度最高、基因多态性最强、与免疫相关最密切的抗原系统，多数有免疫因素参与的疾病 均提示与HLA有关。早从1976年开始，国际上就开展了 HLA与白癜风相关性研究， 并已发现大量HLA等位基因位点与白癜风患病及严重程度有关，并存在着明显的种族 异质性。候选基因的相关性研究国内外白癜风的易感基因筛査仅见少数基因的单核苷酸多 态性研究的零星报道，至今尚无大规模检测的基因芯片研究。2002年，Casp等通过病 例对照研究发现，过氧化氢酶(CAT)基因第9号外显子的T/C改变与白癜风相关，该单 核苷酸多态(SNP)命名为rs769217; 2003年Casp等采用限制性片段长度多态性(RFLP) 的方法对主要组织相容性抗原(MHC)区域内的淋巴细胞相关膜蛋白/运载体相关蛋白 (LMP/TAP)基因族进行研究，已有研究表明该基因族在多种自身免疫病中均存在显著 相关的SNP，结果发现运载体相关蛋白1 (TAP1)、运载体相关蛋白2 (TAP2)、淋巴细胞相 关膜蛋白2 (LMP2)和淋巴细胞相关膜蛋白7 (LMP7)等基因7个SNP与白癜风有关； 2004年，Jin等发现血管紧张素转化酶(ACE)及雌激素受体1 (ESR1)基因的基因多 态性与白癜风相关；Kitamura等通过免疫印迹研究发现，干细胞生长因子受体(KIT) 基因及其抑制因子小眼畸形相关转录因子(MITF-M)在白癜风皮损中明显下降或消失； 2005年多个研究小组发现细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA4)基因的多态性与白癜风 显著相关，该基因抑制T细胞的激活，与多种自身免疫性疾病有关；2005年Canton发 现蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPN2) 2基因多态R620W与泛发型白癜风相关，PTPN22编码 一种酪氨酸磷酸酶，大量研究表明PTPN22基因多态R620W与众多自身免疫性疾病(I 型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等)有关；2005年Alkhateeb等对自身免 疫性疾病易感位点1 (AIS1)易感区域内的9个基因进行了检测，结果发现叉头盒D3 基因(FOX3)启动子区域的一639G4T与家族型白癜风相关；2007年，通过对 17pl3(VAMASl)位点的精细定位和及关联研究发现，17pl3区域内存在与白癜风及/或其 他自身免疫性疾病密切相关的易感基因NALP1，由于研究对象50%以上白癜风患者伴 发其他自身免疫性疾病，影响严重，该重大发现以长篇论著发表在医学领域最权威的新 英格兰医疗杂志《New England Journal of Medicine》(影响因子44.016/2005)，从另一 侧面说明白癜风的自身免疫学基础。综上所述，白癜风是由遗传因子和环境因素共同作用而发病的多基因疾病，寻找白 癜风相关基因进而阐明白癜风的遗传机制已经成为目前研究的热点。本领域迫切需要寻找白癜风易感基因的单核苷酸多态性(SNP)及其风险单体型， 以此作为标记进行白癜风的危险分层；将单核苷酸多态性(SNP)与致病基因突变筛查 相结合，预测患者的临床与预后，并为开展个性化治疗奠定基础。发明内容本发明旨在将单核苷酸多态性(SNP)与致病基因突变筛查相结合，预测患者的 临床与预后，并为开展个性化治疗奠定基础，提供一种用于中国汉族人白癜风相关性的 单核苷酸多态性的检测方法。用于中国汉族人白癜风相关性的单核苷酸多态性的检测方法，包括DNA提取、聚 合酶链式反应扩增、单核苷酸多态性检测、基因型分布差异检验；用上游引物和/或下游引物对提取的DNA进行聚合酶链式反应扩增，得聚合酶链式 反应扩增产物；并用琼脂糖电泳检测扩增产物；对扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定SEQIDNO:l是否存在以下单核苷酸多 态性XBP1基因上游197位的G突变为C。所述上游引物5'陽AAAAATTAGCCGGGTGTGGT-3， (SEQ ID NO: 2); 所述下游引物5，-AATCCCTGGCCAAAGGTACT-3， (SEQ ID NO: 3); 所述上游引物和/或下游引物长度为15-50bp，较佳长度为20-25bp; 所述SEQ ID NO:l序列特征
长度2819bp;类型基因序列；序列描述人类X盒结合蛋白1基因序列。 用于中国汉族人白癜风相关性的单核苷酸多态性的检测方法，具体检测操作步骤如下(1) 、 DNA提取1) 、取500ul白癜风患者血液，加入Iml红细胞裂解液，振荡摇匀，室温放置10 分钟，2500转/分钟离心IO分钟;2) 、去除上清液，加入0.8ml红细胞裂解液，混匀，室温放置10分钟，2500转/分 钟离心10分钟；上述l)、 2)步骤中的红细胞裂解液，包括下列重量配比的物质7.8g氯化铵，1.8g 乙二胺四乙酸，0.8g碳酸氢铵，加去离子水至1L;3) 、再去除上清液，加入80 u 1超纯水，弹开管底沉淀；依次加6lU浓度为10mg/ml 蛋白酶K、 80tU浓度为10%十二烷基磺酸钠；80iU盐酸胍溶液；所述盐酸胍溶液包括下列重量配比的物质72g盐酸胍，10ml浓度为1M三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐，加水至100ml，调节pH值为8.0;4) 、放入70'C水浴锅水浴1小时，前十五分钟要一直振荡；5) 、从水浴中取出，10000转/分钟离心10分钟；6) 、将离心后全部上清液放置于试管中，加2.5倍无水乙醇，振荡，可见DNA沉 淀； 》7) 、去除上清液，加75%乙醇洗涤2次；8) 、在室温下晾干，最后用120ul TE溶解液溶解，紫外分光光度计测量DNA吸 光度值定量，得白癜风患者DNA， -2(rC保存备用；所述TE溶解液包括下列重量配比的物质0.375g乙二胺四乙酸，1.25g三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐，调节pH至8.0。(2) 、聚合酶链式反应扩增操作如下取10y 1聚合酶链式反应体系，该反应体系包括下列物质 1 U 1 10X Taq DNA聚合酶缓冲液；lPl脱氧核糖核苷酸，其中，每种碱基的浓度为2.5mmol/L; 0.25ul弓l物，引物的浓度为20uM; 0.limits Hotstar Taq DNA聚合酶；白癜风患者DNA或正常对照DNA模板20ng， PCR反应的最终体积为10 u 1。 在GeneAmp 9700基因扩增仪上按下述降落PCR程序进行聚合酶链式反应扩增， 具体反应条件为第一步95'C预变性15分钟；第二步94'C变性40秒，63'C退火40秒，72'C延伸40秒，共12个循环，每个循 环退火温度递减0.5'C;第三步94。C变性40秒，57。C退火60秒，72。C延伸70秒，共40个循环； 第四步72'C延伸10分钟，得聚合酶链式反应扩增产物； 用1%琼脂糖凝胶电泳检测有/无特异性的PCR扩增条带。(3)、聚合酶链式反应扩增产物单核苷酸多态性检测操作如下1) 、聚合酶链式反应扩增产物测序前反应聚合酶链式反应扩增产物经SAP-ExonI纯化法纯化，所述纯化体系由下列浓度配比的原料组成扩增产物5Ul; 1U/1U虾碱性磷酸酶0.4iU; 20U/lU核酸外切酶0.25 111; 补水至7ul，混合均匀；反应程序37°C 1小时，80°C 15分钟，得到纯化产物。2) 进行末端双脱氧法测序反应 配制6ul测序反应体系，其包括下列物质 1 U 1快速启动测序试剂盒试剂； liU上述纯化产物；lul上游引物和/或下游引物，引物浓度为5pM，补水至终体积6ul。 将上述6 u 1测序反应体系在GeneAmp 9700基因扩增仪上进行测序反应，反应条 件为94'C变性20秒，50'C退火20秒，60'C延伸4分钟，共30个循环，得6ul反应产物；3) 单核苷酸多态性的发现与检测 ① 测序反应结束后，在测序反应产物中加入配制的2.5lil测序反应终止液，所述 反应终止液由下列浓度配比的原料组成-20°。预冷的浓度为3M、 pH5.2醋酸钠 浓度为100mM， pH8.0的乙二胺四乙酸1 u 1; 浓度为20mg/ml糖原0.5 ix 1;混合均匀，以终止测序反应。② 在终止反应液中然后加入-20。C预冷的30ml的95°/。乙醇，10000转/分钟离心15 分钟；③ 去除上清液，用-2(TC预冷的75。/。酒精洗2遍，晾干后用30iU甲酰胺重悬。
将重悬后的测序反应产物用ABI-PRISMTM 3730 DNA测序仪(美国应用生物系统公司，ABI)进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大 学http:〃droog.mbt.washington,edu/Polyphred.html)进行序列的判读和单核苷酸多态性的 确认。结果是，X盒结合蛋白1基因上游197位存在G/C多态性，即基因上游197位的G 突变为C。聚合酶链式反应扩增产物的长度为100-3000bp，较佳的为150-2000bp，更佳的 为200-1000bp;这些扩增产物都应含有SEQ IDNO:l中基因上游第197位点。本发明的研究结果表明X盒结合蛋白1 (XBP1)基因与中国汉族人白癜风呈显著正 相关，该基因可能是中国汉族人患白癜风的一个主效基因或与之存在紧密的遗传机制。本发明人多年来一直从事白癜风的遗传学研究，收集了 159个白癜风家系和2236 例散发白癜风患者共3164份血样，在白癜风遗传流行病学、基因定位和基因差异表达 等方面己取得一定的成果。2005年本发明人对106个中国汉族人寻常型白癜风核心家系进行全基因组扫描，非 参数连锁分析揭示在染色体4ql3-4q21存在中国汉族人寻常型白癜风易感基因(美国人 类遗传学(Am J Hum Genet) 2005,76(6):1057-65)并被收录在线人类孟德尔遗传数据 库(OMIM)且命名为自身免疫性疾病易感位点4 (AIS4);近期通过增加家系和遗传学 标记进行精细定位，发现22ql2和6p21-p22区域同样存在白癜风易感基因。对中国汉族白癜风的HLA-I类及II类抗原进行了系统研究，发现了多个相关位点并构建了相关的HLA单倍型。本发明中通过连锁分析发现22q12区域为中国汉族人白癜风易感位点，在该区域内 采取功能候选策略，大样本病例对照研究和传递不平衡检验(TDT)分析发现，X盒结合 蛋白1 (XBP1)基因启动子区域单核苷酸多态性(SNP) (-197G/C)与中国汉族人白癜 风显著相关，大大提高了汉族人白癜风患者检测的特异性。本发明操作简单，费用相对较低，精确度高，可自动化进行检测，因此不仅可用于 早期较准确地诊断中国汉族人白癜风，而且可以使携带者在未发病前就采取合理的预防 措施，从而提高携带者的生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。基于本发明的新发现，X盒结合蛋白1 (XBP1)有很多新用途，如检测X盒结 合蛋白1 (XBP1)突变可以预测罹患白癜风的风险性。X盒结合蛋白1 (XBP1)蛋 白突变的形式包括与正常野生型X盒结合蛋白1 (XBP1)基因DNA序列相比的点 突变、易位、缺失、重组和其他任何异常等。可用己有的技术如Southern blot、 DNA 序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用 Northern blot、 Western blot可间接判断基因有无突变。最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用X盒结合蛋白1 (XBP1)基因特 异性引物扩增样品的X盒结合蛋白1 (XBP1)基因，得到扩增产物；然后检测扩增 产物中是否存在以下单核苷酸多态性-197位G—C，其中，核苷酸位置编号基于 SEQ ID NO:l。应理解，在本发明首次揭示了 X盒结合蛋白1 (XBP1)基因的单核苷酸多态性， 与白癜风的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该X 盒结合蛋白1 (XBP1)位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在-197位 G—C 。通常引物的长度为15-50bp，较佳地为20-25bp。一种优选的引物对具有SEQ IDNO:l序列。虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp， 较佳的为150-2000bp，更佳的为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO:l 中第-197位点。
图1为X盒结合蛋白1 (XBP1)基因中-197位点处存在的G/C多态性测序图。
图2为X盒结合蛋白1 (XBP1)启动子-197G/C多态性的等位基因频率、基因型 关联分析表l。图3为X盒结合蛋白l(XBPl)启动子-197G/C多态性传递不平衡检验(TDT)表2。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例主要试剂及仪器HotstarTaqDNA聚合酶、dNTP购自华美生物工程公司，化学试剂购自国产化学试 剂商店，测序试剂、3730型测序仪均为美国应用生物系统公司(ABI公司)。 第一步基因组脱氧核糖核酸(DNA)的提取由于白癜风是多种环境因素和多基因参与的多因子病，在分析相关基因时必然要考 虑遗传异质性的问题。选择遗传背景相对比较单一的隔离人群作为研究多基因疾病的材 料将有助于降低遗传异质性的影响。同时由于这些群体具有比较固定的生活环境和较为 一致的生活习惯使得环境因素的影响大大降低。选择这样的群体，不论是用于连锁不平 衡分析还是从中选取家系进行家系分析，都有提高白癜风易感基因位点的检测灵敏度。 因此在本实施例中选择隔离群体作为研究对象(隔离群体具有遗传背景的相对一致性， 奠基者数目比较少的优点)。取白癜风患者和对照组外周静脉血3-5ml， 0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，直 接用于提取基因组DNA，或者-8(TC冻存备用。按如下方法提取基因组DNA:① 取500ii 1白癜风患者血液，加入lml红细胞裂解液，振荡摇匀，室温放置10分钟， 2500转/分钟离心10分钟；② 去除上清液，加入0.8ml同上述的红细胞裂解液，混匀，室温放置10分钟，2500转 /分钟离心10分钟； 上述l)、 2)步骤中的红细胞裂解液，包括下列重量配比的物质7.8g氯化铵，L8g 乙二胺四乙酸，0.8g碳酸氢铵，加去离子水至1L;③再去除上清液，加80"1超纯水，弹开管底沉淀；依次加6yl浓度10mg/ml蛋白酶K; 80Ul浓度10%十二烷基磺酸钠；80Ul盐酸胍溶液；所述盐酸胍溶液包括以下重量配比的物质72g盐酸胍，10ml浓度为1M的三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，加水至100ml，调节pH值为8.0; 放入7(TC水浴锅水浴1小时，前十五分钟要一直振荡； ⑤从水浴中拿出，10000转/分钟离心10分钟； 取离心后全部上清液放置于10ml试管中，加2.5倍无水乙醇，振荡，可见DNA沉 淀；⑦ 去除上清液，加75%乙醇洗涤2次；⑧ 在室温下晾干，最后用120ul最后用120yl TE溶解液溶解，紫外分光光度计测量 DNA吸光度值(OD值)定量，得白癜风患者DNA， -20°。保存备用；所述TE溶解液包括下列重量配比的物质0.375g乙二胺四乙酸，1.25g三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐，调节pH至8.0。第二步引物设计和PCR扩增为了检测X盒结合蛋白1 (XBP1)基因中的多态性，本发明进行了聚合酶链式反 应(PCR)和荧光标记末端终止法测序，根据美国基因数据库(GeriBank)中X盒结合 蛋白1 (XBP1)基因序列(登录号为NM—005080.2)，针对5'UTR (非转录区域)设 计1对特异性引物，扩增片段大小为845bp (碱基对)，分别以白癜风患者和正常对照 的基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。引物由上海生物化工公司 合成，引物序列为上游引物5 ， - AA A A ATTAGCCGGGTGTGGT-3' (SEQ ID NO: 2);下游引物5，-AATCCCTGGCCAAAGGTACT-3， (SEQ ID NO: 3);lOul聚合酶链式(PCR)反应体系1 U 1 10X Taq DNA聚合酶缓冲液；1 " 1脱氧核糖核苷酸'(dNTPs，每种碱基的浓度为2.5mmol/L); 0.25nl弓l物，引物的浓度为20uM; 0.1units Hotstar Taq DNA聚合酶;
白癜风患者DNA或正常对照DNA模板20ng,PCR反应的最终体积为10μl. 在GeneAmp9700基因扩增仪(Perkin-Elmer)上按如下述降落PCR程序进行聚合酶链式反应扩增,聚合酶链式反应具体条件为: 第一步:95℃ 预变性15分钟; 第二步:94℃ 变性40秒,63℃ 退火40秒,72℃ 延伸40秒,共12个循环,每个循环退火温度递减0.5℃ ; 第三步:94℃ 变性40秒,57℃ 退火60秒,72℃ 延伸70秒,共40个循环; 第四步:72℃ 延伸10分钟,得聚合酶链式反应扩增产物;
用1%琼脂粮凝胶电泳检测有/无特异性的PCR扩增条带. 第三步:荧光标记末端终止法测序检测X盒结合蛋白1(XBP1)基因中的多态性 1.聚合酶链式反应(PCR)扩增产物测序前反应 1),聚合酶链式反应扩增产物经SAP-Exonl纯化法纯化,纯化体系由下列浓度配比的原料组成": 扩增产物:5μl 1U/μl是碱性磷酸酶:0.4μl 20U/μl核酸外切酶:0.25 μl 补水至7μl,混合均匀; 反应程度:37℃ 1小时,80℃ 15分钟,得到纯化产物.
2)末端双脱氧法测序反应:自配6μl测序反应体系,其包括下列物质:1μl快启动测序试剂盒试剂试剂(DTCS Kit);1μl聚合酶链式(PCR)反应扩增产物;1μl上游引物或下游引物(5pM),加水至终体积6μl在GeneAmp9700基因扩增仪(Perkin-Elmer)上进行测序PCR反应.反应条件为:94℃ 变性20秒,50℃ 退火20秒,60℃ 延伸4分钟,共30个循环,得6μl反应产物.
2.单核甘酸多态性的发现与检测
1)测序反应结束后,在测序反应产物中加入配制的2.5μl测序反应终止液,反应
终止液由下列浓度配比的原料组成-2(TC预冷的浓度为3M、 pH5.2醋酸钠1 u 1; 浓度为100mM， pH8.0的乙二胺四乙酸1 u 1; 浓度为20mg/ml糖原0.5 ul;混合均匀，以终止测序反应。② 在终止反应液中然后加入-20。C预冷的30ml的95%乙醇，10000转/分钟离心15 分钟；③ 去除上清液，用-20"预冷的75%酒精洗2遍，晾干后用30ul甲酰胺重悬。 将重悬后的测序反应产物用ABI-PRISMTM 3730 DNA测序仪(美国应用生物系 统公司，ABI)进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大 学http:〃droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和单核苷酸多态性的 确认。结果发现，X盒结合蛋白l (XBP1)基因上游197位存在G/C多态性，见图l。 不同群体X盒结合蛋白l(XBPl)基因型分布差异检验本实施例对143个先证者，689个散发病例以及718个正常对照进行了检测。利用 SPSS10.0软件进行统计分析，结果发现，等位基因频率和基因型频率均具有显著性差异， 见图2。 -为了进一步验证该研究结果，我们从143个家系中挑选出94个三人核心家系(患 者及其父母)，针对X盒结合蛋白1 (XBP1)启动子-1970/(3进行测序，利用Haploview 软件进行传递不平衡检验(TDT)，同样表明具有显著性意义(p=0.0049，见图3)。综上所述，X盒结合蛋白1 (XBP1)启动子区域单核苷酸多态(-197G/C)的等位 基因频率、基因型频率在大样本病例对照研究中存在显著性差异，在94个核心家系的 传递不平衡检验(TDT)中同样具有显著性意义，这些结果均表明X盒结合蛋白l(XBPl) 基因与中国汉族人白癜风呈显著正相关，该基因可能是中国汉族人患白癜风的一个主效 基因或与之存在紧密地遗传机制。可以用来检测汉族人白癜风疾病，也可以用来预测中 国汉族人患白癜风的风险。
序列表<110>安徽医科大学皮肤病研究所<120>用于中国汉族人白癜风相关性的单核苷酸多态性的检测方法 <160>3<170> Patent In Version 3.1 <210> 1 <211>2819 <212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<220><221> CDS<222>(549)...(1334)<400> 1卿cggagtctcgctctgtcgcccaggccggggtgcagtggcgcgatctc50ggctcactgaaacctctgtccagtcttttcgaacccaaggcccaactgcg100ctctatctcgactttcggctccactcggatcccgaagtggcgcacgagat150aaaeitgttgtcaggctgaggtaattctctgttagtcccggtasswttcg200tcagtctggaaagctctcggtttggaattaaattctgtcactccggatgg250aaataagtccgcttaagggggg朋aatccgtttgtggaggacacgctccc300gcacgtaaccccccgcggaaaatgaccccaagtacctttggccagggatt350gccgctgccacgccggactccatagccacggtcctgaaacgccccgccgg400gc鄉ccggaCC肪tgg3Cgccgagctcggccgtgcgtcacgcgacgctg450gccaatcgcggagggccacgaccgtsgaaaggccgggcgcggcgaggctg500ggcgctgggcggctgcggcgcgcggtgcgcggtgcgtagtctggagctat550ggtggtggtggcagccgcgccgaacccggccgacgggacccctaaagttc600tgcttctgtcggggcagcccgcctccgccgccggagccccggccggccag650gccctgccgctcatggtgccagcccagagaggggccagcccggaggcagc700gagcggggggctgccccaggcgcgcaagcgacagcgcctcacgcacctg3750gccccgaggagaaggcgctg3gt3gC8lgCt800cagactgccagagatcgaaagaaggctcgaatgagtgagctggaacagca850agtggt卿tttag肪gaagagaaccaaaeiacttttgctagaasatceigc900ttttacgagagaaaactcatggccttgtagttgagaaccaggetgtt3卿950cagcgcttggggatggatgccctggttgctga卿gg鄉cggaagccaa画gggg幼tg朋gtgaggccag'tggccgggtctgctgagtccgcagcactca1050gactacgtgcacctctgcagc郷tgcaggcccagttgtcacccctccag1100
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权利要求
1、用于中国汉族人白癜风相关性的单核苷酸多态性的检测方法，包括DNA提取、聚合酶链式反应扩增、单核苷酸多态性检测，其特征在于用上游引物和/或下游引物对提取的DNA进行聚合酶链式反应扩增，得聚合酶链式反应扩增产物；并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；对扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定SEQ ID NO1是否存在以下单核苷酸多态性XBP1基因上游197位的G突变为C；所述上游引物5’-AAAAATTAGCCGGGTGTGGT-3’(SEQ ID NO2)；所述下游引物5’-AATCCCTGGCCAAAGGTACT-3’(SEQ ID NO3)；所述上游引物和/或下游引物长度为15-50bp，较佳长度为20-25bp；所述SEQ ID NO1序列特征长度2819bp；类型基因序列；序列描述人类X盒结合蛋白1基因序列。
2、 根据权利要求1所述的用于中国汉族人白癜风相关性的单核苷酸多态性的检测 方法，其特征在于具体检测操作步骤如下(1)、 DNA提取1) 、取500ul白癜风患者血液，加入lml红细胞裂解液，振荡摇匀，室温放置10 分钟，2500转/分钟离心10分钟；2) 、去除上清液，加入0.8ml红细胞裂解液，混匀，室温放置IO分钟，2500转/分 钟离心IO分钟；上述l)、 2)步骤中的红细胞裂解液，包括下列重量配比的物质7.8g氯化铵，1.8g 乙二胺四乙酸，0.8g碳酸氢铵，加去离子水至1L;3) 、再去除上清液，加入80lU超纯水，弹开管底沉淀；依次加6u 1浓度为10mg/ml 蛋白酶K、 80ul浓度为10%十二烷基磺酸钠；80lU盐酸胍溶液；所述盐酸胍溶液包括下列重量配比的物质72g盐酸胍，10ml浓度为1M三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐，加水至100ml，调节pH值为8.0; 4) 、放入70。C水浴锅水浴1小时，前十五分钟要一直振荡；5) 、从水浴中取出，10000转/分钟离心10分钟；6) 、将离心后全部上清液放置于试管中，加2.5倍无水乙醇，振荡，可见DNA沉淀；7) 、去除上清液，加75%乙醇洗涤2次；8) 、在室温下晾干，最后用120ul TE溶解液溶解，紫外分光光度计测量DNA吸 光度值定量，得白癜风患者DNA， -20匸保存备用；所述TE溶解液包括下列原料配比的物质0.375g乙二胺四乙酸，1.25g三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐，调节pH至8.0;(2) 、聚合酶链式反应扩增操作如下取10H1聚合酶链式反应体系，该反应体系包括下列物质1 U 110X Taq DNA聚合酶缓冲液；lul脱氧核糖核苷酸，其中，每种碱基的浓度为2.5mmol/L; 0.25ul弓i物，引物的浓度为20yM; O.lunits Hotstar Taq DNA聚合酶；白癜风患者DNA或正常对照DNA模板20ng， PCR反应的最终体积为10 n 1; 在GeneAmp 9700基因扩增仪上按下述降落PCR程序进行聚合酶链式反应扩增， 具体反应条件为第一步95X:预变性15分钟；第二步94。C变性40秒，63'C退火40秒，72'C延伸40秒，共12个循环，每个循 环退火温度递减0.5°C;第三步94。C变性40秒，57。C退火60秒，72。C延伸70秒，共40个循环； 第四步72'C延伸10分钟，得聚合酶链式反应扩增产物； 用1%琼脂糖凝胶电泳检测有/无特异性的PCR扩增条带；(3) 、聚合酶链式反应扩增产物单核苷酸多态性检测操作如下 1)、聚合酶链式反应扩增产物测序前反应聚合酶链式反应扩增产物经SAP-ExonI纯化法纯化，所述纯化体系由下列浓度配比的原料组成 扩增产物5Ul; 1U/Pl虾碱性磷酸酶0.41U ; 20U/Ul核酸外切酶0. 25ul;补水至7yl，混合均匀；反应程序37°C l小时，8CTC 15分钟，得到纯化产物；2) 、进行末端双脱氧法测序反应配制6yl测序反应体系，其包括下列物质 1 U 1快速启动测序试剂盒试剂； lUl上述纯化产物；1lU上游引物和/或下游引物，引物浓度为5pM，补水至终体积6lU;将上述6 u 1测序反应体系在GeneAmp 9700基因扩增仪上进行测序反应，反应条 件为94。C变性20秒，50。C退火20秒，6(TC延伸4分钟，共30个循环，得6yl反应 产物；3) 、单核苷酸多态性的发现与检测① 测序反应结束后，在测序反应产物中加入配制的2.5ul测序反应终止液，所述 反应终止液由下列浓度配比的原料组成-2(TC预冷的浓度为3M、 pH5.2醋酸钠1 y 1; 浓度为100mM， pH8.0的乙二胺四乙酸1 " 1; 浓度为20mg/ml糖原0.5 ul; 混合均匀，以终止测序反应；② 在终止反应液中然后加入-20。C预冷的30ml的95%乙醇，10000转/分钟离心15 分钟；③ 去除上清液，用-20'C预冷的75。/。酒精洗2遍，晾干后用30iU甲酰胺重悬；④ 将重悬后的测序反应产物用ABI-PRISMTM3730DNA测序仪(美国应用生物系 统公司，ABI)进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大 学http:〃droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和单核苷酸多态性的 确认；结果是，X盒结合蛋白1基因上游197位存在G/C多态性，即基因上游197位的G突变为c。
3、根据权利要求1所述的用于中国汉族人白癜风相关性的单核苷酸多态性的检测 方法，其特征在于聚合酶链式反应扩增产物的长度为100-3000bp，较佳的为150-2000bp，更佳的 为200-1000bp;这些扩增产物都应含有SEQ IDNO:l中基因上游第197位点。
全文摘要
本发明涉及用于中国汉族人白癜风相关性的单核苷酸多态性的检测方法。解决将单核苷酸多态性(SNP)与致病基因突变筛查相结合，预测汉族人白癜风患者的临床与预后的问题。具体方法包括DNA提取、用上游引物和/或下游引物对提取的DNA进行聚合酶链式反应扩增、单核苷酸多态性检测确定SEQ ID NO1是否存在XBP1基因上游197位的G突变为C、X盒结合蛋白1(XBP1)基因型分布差异检验。本发明操作简单，费用相对较低，精确度高，可自动化进行检测，因此不仅可用于早期较准确地诊断中国汉族人白癜风，而且可以使携带者在未发病前就采取合理的预防措施，从而提高携带者的生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。
文档编号G01N21/31GK101149340SQ20071002609
公开日2008年3月26日 申请日期2007年8月22日 优先权日2007年8月22日
发明者张学军, 方巧云, 森 杨, 梁燕华, 敏 高 申请人:安徽医科大学皮肤病研究所