专利名称：一种毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方法
技术领域：
本发明涉及一种毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方法。该 方法为研究毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的不可逆吸附现象提供一种可视化的、 操作简单的表征手段。 本发明的另一目的，在于为蛋白质涂层或者脂质体-蛋白质复合涂层的厚度、均 匀性和稳定性的表征提供一种有力的分析方法。 毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质荧光成像方法，其具体技术方案是首先， 将蛋白质固定到毛细管和微流控芯片电泳通道中，这一过程既可以是在蛋白质的分离过程 中发生，也可以是人为地通过物理或化学方法在通道内构建蛋白质涂层；然后，将蛋白质荧 光染料充入到微通道内并静置5-60min，进行蛋白质的荧光染色；接着，用无荧光干扰的溶液或溶剂将未结合的荧光染料洗净；最后，在荧光显微镜上，根据荧光染料的激发波长选定 观测条件，进行成像观测和图像分析。全部操作过程在4-37t:条件下进行。
其中，荧光染料是指能够与蛋白质发生共价或非共价作用并结合的有机荧光染 料，包括但不仅限于荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明B，四甲基罗丹明(TMR)， SYPROOrange， SYPRO Red, SYPRO Ruby，吖啶红，cy3和cy5。 本发明所涉及的方法，在蛋白质的非特异性吸附以及蛋白质涂层的表征方面，具 有操作简单、灵敏度高、直观形象和快速的优点。
图1为石英毛细管进样端吸附蛋白质的荧光显微镜图。 图2为聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片电泳通道吸附蛋白质的普通光学显微镜图 (1)和荧光显微镜图(2)。 图3为低密度脂蛋白涂层(1)、人血清白蛋白涂层(2)、卵黄蛋白原涂层(3)和无 涂层毛细管(4)的荧光显微镜图。
具体实施例方式
实施例1石英毛细管上非特异性吸附蛋白质的荧光成像分析
取一支内径为50ym的熔融石英毛细管(总长31cm，有效长度21cm)，接入 Beckman MDQ毛细管电泳系统，在+15kY电压、20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、压力进样 (0. 5psi，5s)条件下，连续5次运行0. 2mg/mL蛋白质混合样品(溶菌酶、细胞色素c、核糖 核酸酶A和a-糜蛋白酶原A)的分离。操作完成后，将毛细管继续用20mM磷酸盐缓冲液 (pH 7. 4)冲洗10min。 量取1. 0 ii L的SYPRO Orange荧光染料，用5mL的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4) 稀释并混匀。将该溶液灌充入毛细管中，室温下静置15-30min，进行染色。染色完成后，用 20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和去离子水冲洗各10min。将毛细管从仪器中取出，缓缓通入 高纯氮气l-2min。用石英切割器将毛细管平均切为3段，分别标记为进样端、中间部分和流 出端，并刮去表面聚酰亚胺包覆层。最后，用Zeiss AxioSkop 40型荧光显微镜进行观测， 图像用CCD和数码相机采集。 根据荧光图像结果分析发现，蛋白质在毛细管壁的吸附主要发生在进样端(见附 图1)。实施例2微流控芯片上非特异性吸附蛋白质的荧光成像分析 取一片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基质的微流控芯片，其尺寸为长50mm，宽30mm， 厚度3mm，并刻有35mm长、基底宽约130 y m的分离通道，在场强200V/cm、缓冲液40mM磷酸 盐(pH 7. 2)条件下，连续5次运行0. 2mg/mL蛋白质混合样品(溶菌酶、细胞色素c、核糖核 酸酶A和a-糜蛋白酶原A)的分离。操作完成后，微通道继续用40mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)冲洗10min，然后用SYPRO Orange荧光染料(稀释5000倍)染色15min。染色完成 后，用20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和去离子水冲洗各10min，最后用Zeiss AxioSkop40型 荧光显微镜进行观测，图像用CCD和数码相机采集。 根据荧光图像结果可以看出，在PMMA基质的微流控芯片上，在进样端(即十字交 叉处)通道内，蛋白质的吸附情况比较严重(见附图2)，说明PMMA材料对蛋白质有较强的
4非特异性吸附作用。 实施例3低密度脂蛋白(LDL)毛细管涂层的荧光成像分析 低密度脂蛋白(LDL)的毛细管涂层采用化学键合法制备先用10%氨丙基三甲氧 基硅烷的甲醇溶液对一支内径为50iim的毛细管进行硅烷化修饰，引入氨基活性基团；然 后用5%戊二醛(在20mM磷酸盐缓冲液中，pH 7. 4)处理毛细管2h ;再将lmg/mL的LDL溶 液(在20mM磷酸盐缓冲液中，pH 7. 4)冲入毛细管中，2(TC下反应2h ;最后再用0. 5mg/mL 的氰基硼氢化钠溶液(PH 6. 0)还原，并用20mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)和去离子水冲洗毛 细管各10min。 量取1. 0 ii L的SYPRO Orange荧光染料，用5mL的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4) 稀释并混匀。将该溶液充入到上述低密度脂蛋白涂层的毛细管中，封闭两端，室温下静置 15min。再用20mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)和去离子水冲洗毛细管各10min。最后用Zeiss AxioSkop40型荧光显微镜进行观测，图像用CCD和数码相机采集。荧光成像结果见附图 3(1)。 实验结果表明，荧光成像的方法可用于蛋白质涂层厚度、均匀性等性能的表征。
实施例4 称取2. Omg人血清白蛋白(HSA)，充分溶于lmL的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)中， 混匀，制得人血清白蛋白涂层溶液。取一支石英毛细管(内径50ym)，依次用1M的NaOH、 二次水、1M盐酸、二次水处理15-30min，高纯氮气吹干。将上述HSA溶液灌充到毛细管中， 用硅橡胶封住两端，于室温下静置2h。重复上述灌充和静置操作1次。用20mM磷酸盐缓冲 液(pH 7.4)将管内溶液冲去，并持续清洗10min，制得人血清白蛋白装涂层。
量取1. Omg的异硫氰酸荧光素(FITC)，用5mL的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4) 稀释并混匀。将该溶液充入到上述人血清白蛋白涂层的毛细管中，封闭两端，室温下染色 30min。再用20mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)和去离子水冲洗毛细管各10min。最后用Zeiss AxioSkop40型荧光显微镜进行观测，图像用CCD和数码相机采集。荧光照片见附图3 (2)。
实验结果表明，不同种类的荧光染料，仅需选择合适的滤光片对激发波长进行调 制，都可进行荧光成像分析。 实施例5卵黄蛋白原(Vtg)毛细管涂层的荧光成像分析 卵黄蛋白原(Vtg)涂层毛细管的制作和表征与实施例3所述方法类似，仅需将实 施例3中的低密度脂蛋白换成卵黄蛋白原，同时将毛细管内径改为100 ym。其荧光照片见 附图3(3)。 由荧光成像结果可以看出，荧光强度可以反映涂层厚度、均匀程度和稳定性等信 息，但对于蛋白质的种类没有明显的区分。
权利要求
一种毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方法，其特征在于，采用荧光染料对毛细管和微流控芯片电泳通道中的蛋白质进行染色，并使用荧光显微镜进行成像分析。
2. 根据权利要求1所述的毛细管和微流控芯片电泳通道蛋白质的荧光成像表征方法， 其特征在于，用于表征蛋白质在毛细管内壁和微流控芯片电泳通道上的吸附行为。
3. 根据权利要求1所述的毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方 法，其特征在于，用于表征毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质涂层的厚度、均匀性和稳 定性，并可用于观测蛋白质与生物大分子间的相互作用。
4. 根据权利要求1所述的毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方 法，其特征在于，具体技术方案为将蛋白质固定到毛细管或微流控芯片电泳通道中，这一 过程既可以是在蛋白质的分离过程中发生，也可以是人为地通过物理或化学方法在通道内 构建的蛋白质涂层；然后，将荧光染料充入到微通道内并静置5-60min，进行蛋白质的荧光 染色；接着，用无荧光干扰的溶液或溶剂将未结合的荧光染料冲洗10-30min ;最后，在荧光 显微镜上，根据荧光染料的激发波长选定观测条件，进行成像分析。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，全部操作在4-37t:条件下进行。
全文摘要
本发明涉及一种毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像方法，用以表征毛细管或微流控芯片电泳通道中蛋白质的非特异性吸附现象，并可用于评价蛋白质涂层材料的性能。方法的原理为将荧光染料充入到有蛋白质吸附或有蛋白质涂层的毛细管或微流控芯片通道内静置5-60min，进行蛋白质的荧光染色；用无荧光干扰的溶液将未结合的荧光染料洗净；最后用荧光显微镜进行成像观测和图像分析。操作过程在4-37℃进行。本方法在蛋白质的非特异性吸附以及蛋白质涂层的表征方面，具有操作简单、灵敏度高、直观形象和快速的优点。
文档编号G01N21/64GK101750448SQ20081024010
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者宋茂勇, 尹俊发, 汪海林, 王智鑫 申请人:中国科学院生态环境研究中心