专利名称：一种用于检测羊bmpr-ib基因多态性的pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和动物育种领域。具体地涉及BMPR-IB基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,缩写为SNP)及其与羊产盖数的相关性,涉及检测这些SNP的试剂盒。
背景技术：
研究发现，Booroola美利奴羊的多胎性能是由位于常染色体上FecB基因发生突变所致，FecB基因的突变对绵羊排卵率是基因的加性效应，对窝产羔数呈部分显性效应，绵羊FecB基因实际为骨骼形态蛋白IB型受体(BMPR-IB)基因，由于该基因A746G碱基突变导致第249位的谷氨酸突变为精氨酸(Q — R)，导致绵羊排卵数和窝产羔数增加，并且证 明BMPR-IB基因为影响绵羊的产羔数的主效基因，可以用于对绵羊产羔数的选择。目前，国内外研究人员开始应用BMPR-IB基因开展分子标记辅助选育多胎绵羊，新西兰Genomnz实验室正在进行BMPR-IB基因的基因标记辅助选择。刘守仁等经多年研究，培育出多胎细毛羊品系核心群，繁殖率达182%，较同等条件下的细毛羊提高60% 70%，又利用多胎基因BMPR-IB基因标记的方法，培育肉毛兼用美利奴，证明绵羊多胎性状主效基因标记辅助育种在利用优良品种与我国地方品种杂交提高产肉性能方面具有一定的优势。对于绵羊多胎基因突变位点的检测国内外也做了大量的工作，多采用检测单个碱基的差异(或突变)来标示其多态性。近年来，SNP检测方法和相关仪器的研发进展很快，已报道并建立了多种SNP检测方法。传统的代表方法有限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphisms, RFLP),单链构象多态性(single strand conformationpolymorphisms, SSCP)、等位基因特异的寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide,AS0)杂交等。对于绵羊多胎基因的检测，常用方法是PCR-RFLP，PCR之后再酶切，再电泳，费时费力。该工作重复劳动多，消耗高，自动化程度低，该手段目前已经不适应大规模、低消耗和自动化的要求，因此，建立一种能够自动化、简便、快速的绵羊BMPR-IB基因分型方法势在必行。随着荧光定量PCR仪的普及，利用探针技术的的快速、特异性和敏感性，可以更方便快捷地进行大规模多态性检测。本研究旨在利用探针技术的优点，建立绵羊BMPR-IB基因分型方法，使之易于应用在大规模群体的检测中。
发明内容
本发明的目的即是提供一种新的用于羊BMPR-IB基因分型的PCR试剂盒。本发明还提供了一种检测样本中是否存在BMPR-IB基因的SNP的方法，该方法包括如下步骤(I)利用我们自己设计的试剂盒扩增BMPR-IB基因，得到PCR扩增产物。(2)利用FRET探针技术对扩增产物进行基因分型。本发明中，扩增产物大小为219bp，其中含有A746G。
为实现本发明的目的，本发明的基本技术路线是I、提取绵羊基因组DNA，设计引物进行PCR扩增，利用RFLP进行基因分型。2 J^BMPR-IB基因第6个内含子进行测序。3、设计探针及引物，对已经分型的样品利用FRET探针检测，最后利用测序验证分型的正确性。利用RFLP用于对BMPR-IB基因进行分型所依据的序列可以从Genbank中获得，编号为NM_001009431 ;用于进行探针设计的序列是经过测序获得的。本发明特别地提供了一种使用方便，灵敏度高的对上述基因分型的检测试剂盒，它含有PCR特异扩增弓I物和用于PCR扩增检测的PCR反应液(如试剂、缓冲液等常规组件)，以及用于基因分型的FRET探针等。
具体来说，本发明提供了一种快速高效检测羊BMPR-IB基因多态性的PCR试剂盒，其特征是由分离包装的引物F、引物R、探针Anchor、探针Sensor和PCR反应液构成，其中，引物F和R的序列为F5-AGAGGACAATAGCAAAGCA-3 ；R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3 探针Anchor、sensor 序列为Anchor probe AGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BlackHQ ；Sensor probe FAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG-P04在所述探针Anchor、sensor上，BlackHQ是一种淬灭剂，FAM是绿色突光标记物。就本发明来说，试剂盒中的PCR反应液可以直接由市售的现有产品充当，如TransGen 公司生产的 TransStartTMProbe qPCR superMix 以及 CW BIO 公司生产的GoldStar TaqMan Mixture 或是 2*Es Taq MasterMix (无染料)。本发明的主要技术贡献在于I、获得BMPR-IB基因的第6内含子序列；2、针对上述突变点设计出了用于探针检测的引物和探针；3、利用FRET探针技术检测PCR产物中的多态性，证实此方法正确可靠。需要特别说明的是，就本发明的试剂盒来说，引物F、引物R、探针Anchor、探针Sensor和PCR反应液之间的用量比例的选取是次要的，即该用量比例的选取并不构成本发明技术方案的必要条件。在试剂盒产品中，引物F、引物R、探针Anchor、探针Sensor和PCR反应液之间的比例可针对不同的用户需求而做出调整。为了让本试剂盒的制作更为简便，本发明推荐采用如下用量比例方案当以25ul反应体系为基准时，试剂盒中包含12. 5ul probe mixPCR反应液，0. 2uM引物F、IuM引物R、
0.2uMAnchor probe、0. IuM Sensor probe。在检测时，取用 IulDNA(20_50ng)样本加入上述反应体系。通过调节加入的水量，让引物F为0. 2uM、引物R为luM、Anchor probe为0. 2uM、Sensor probe 为 0. IuM0另外，FRET技术是早已存在的技术，但迄今为止，国内外尚无公开报道将其应用于BMPR-IB基因分型中。现对FRET技术简述如下
原理FRET探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3 ‘末端有一个供体基团，下游探针在5 ‘末端有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。(如图I所示)基因点突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记.如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度。这样便可对基因的突变和多态 性进行分析。本发明采用的改进的FRET探针原理我们所设计的是经过改进的FRET探针，上游探针不标记荧光信号，只携带淬灭基团。I、采用荧光基团与淬灭基团的组合代替了之前的两个荧光基团(荧光能量共振转移)；2、在退火阶段，57°C检测时(温度较高，时间较短)，两条探针没有充分杂交上去，所以没有信号的变化；3、熔解曲线体现的是sensor探针的熔解过程，anchor探针是Tm较高的探针,在sensor探针熔解反应前保持杂交于目标序列；4、在熔解过程中，当两个探针都结合上去时，因为淬灭剂的存在，荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，所以产生了一个倒置的峰。这样在所有的荧光定量PCR仪上只利用一个通道在不到两个小时就能对36，72，96，甚至多达384个样本(根据所使用仪器的孔道)进行检测。
图I是FRET技术原理图。图2是实施例中的基因分型结果图。图3是实施例中的基因分型结果表格图。
具体实施例方式本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。实施例本实施例中的试剂盒是由分离包装的引物引物F、引物R、探针Anchor、探针Sensor和PCR反应液构成，其中引物F和R的序列为F5-AGAGGACAATAGCAAAGCA-3 R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3 探针序列为
Anchor probe AGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BIackHQ ；Sensor probe FAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG-P04在所述探针Anchor、sensor上，BlackHQ是一种淬灭剂，FAM是绿色突光标记物。本实施例中的试剂盒以25ul反应体系为基准制作，试剂盒中包含12. 5ul probemixPCR 反应液，0. 2uM 引物 F, IuM 引物 R,0. 2uMAnchor probe,0. IuM Sensor probe。在检测时，取用IulDNA(20-50ng)样本加入上述反应体系。为了进一步说明本实施例中所制作试剂盒的使用方法和使用效果，下面继续说明将上述试剂盒用于BMPR-IB基因多态性分型的具体过程及使用效果。实验步骤 I、DNA提取按照常规的DNA提取方法或试剂盒进行DNA提取。2、目的基因的实时PCR扩增采用上述试剂盒对目的基因BMPR-IB进行PCR扩增。扩增时使用的机器为澳大利亚 Corbett Life Science 公司的 Rotor-Gene 6000。PCR反应程序950C 30s95 °C 10S55°C 20S 50cycles72 °C 30S熔解分析程序95 °C IMin40 °C 5Min40°C升温至75°C，I0C /5S FAM通道检测荧光3、点突变SNP分析。根据熔解峰位置的不同，判断不同的基因型。突变型的熔解峰位于野生型之前，杂合熔解峰横跨两者。(如图2所示，倒置峰经过180度翻转，便于分析)设置好峰库，编辑好名称后，分型结果直接出现在屏幕下方的表格中。(如图3所示)通过对105个样本进行试验，20个样本进行测序验证，证实此技术方法正确可靠。需要说明的是，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种用于检测羊BMPR-IB基因多态性的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括分离包装的引物F、引物R、探针Anchor、探针Sensor和PCR反应液， 所述引物F和R的序列为F5-AGAGGACAATAGCAAAGCA-3 ；R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3 ； 所述探针Anchor、sensor序列为Anchor probe AGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BIackHQ ；Sensor probe :FAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG_P04。
2.根据权利要求I所述的用于检测羊BMPR-IB基因多态性的PCR试剂盒，其特征在于在所述探针Anchor、sensor上，BlackHQ是一种淬灭剂，FAM是绿色突光标记物。
3.根据权利要求I所述的用于检测羊BMPR-IB基因多态性的PCR试剂盒，其特征在于当以25ul反应体系为基准时，试剂盒中包含12. 5ul probe mixPCR反应液，0. 2uM引物F、IuM 引物 R、0. 2uMAnchor probe、0. IuM Sensor probe。
全文摘要
一种用于检测羊BMPR-IB基因多态性的PCR试剂盒，包括分离包装的引物F、引物R、探针Anchor、探针Sensor和PCR反应液，引物F和R的序列为F5-AGAGGACAATA GCAAAGCA-3；R5-TGAACATCGCTAATACAGACTT-3；探针序列为Anchor probeAGGCCAGCTGGTTCCGAGAGA-BlackHQ；Sensor probeFAM-AGAAATATATCAGACGGTGTTG-PO4。
文档编号G01N21/64GK102732605SQ201110282240
公开日2012年10月17日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者刘彦琴, 刘月琴, 孙洪新, 张英杰, 李雪梅, 杨佳栋, 王红娜, 董李学 申请人:河北农业大学