专利名称：同时检测大叶蒟中12个酰胺类生物碱的液相分析方法
技术领域：
本发明涉及中药制药领域中的分析方法，尤其是一种液相分析方法。
背景技术：
大叶筠Piper laetispicum C. DC.，为胡椒科胡椒属植物，主要分布在我国广东、广西、云南及海南省。民间用于活血、消肿、止痛，主治跌打损伤、瘀血肿痛。复旦大学药学院在进行抗抑郁天然药物的筛选时首次发现大叶筠具有较强的抗抑郁作用，并对其做了比较全面的研究。目前从大叶筠各部位中分离得到了20多个化合物，主要为酰胺类生物碱类。实验证明，这类化合物正是大叶筠抗抑郁的物质基础。分析方法的建立有助于加快大叶筠有效成分的进一步研究，也为今后大叶筠相关产品的质量控制提供了技术支持。但是由于大叶筠中的生物碱结构、理化性质均比较相近，分离难度较大。仅有一篇文献[董栋，大叶筠抗抑郁有效成分制备工艺、质量标准及大叶筠挥发油化学成分研究，2008]中报道了一种简单的HPLC分析方法，该方法只针对其中5个化合物，但不能很好的分离大多数酰胺类生物碱以及其他杂质。因此精度不高，实际操作过程中容易出现差错。鉴于以上原因，我们开发了能同时检测12个酰胺类生物碱的液相分析方法，可以用于其中任意几种化合物的检测。
发明内容
本发明目的在于开发一种 能同时检测大叶筠中12个酰胺类生物碱的液相分析方法。从而有助于加快大叶筠抗抑郁有效成分的进一步研究，也为今后大叶筠相关产品的质量控制提供了技术支持。为此，本发明提供了一种大叶筠中12个酰胺类生物碱的含量测定方法，该方法采用了 C18色谱柱，二元洗脱系统，以及DAD检测器，用于大叶筠及相关产品中以下12个酰胺类生物碱中任意1-12个化合物的同时测定；化合物1:5,-甲氧基-3' ,4!-次甲二氧基桂皮酸四氢吡咯；化合物2:5」甲氧基-3' ,4f -次甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺；化合物3 :1-[(2Ε，4Ε)-9-(3，4-次甲二氧基苯)七碳二烯酰]四氢吡咯；化合物4 :(2E，4E)-N-异丁基-9-(3，4-次甲二氧基苯)七碳二烯酰胺；化合物5 :1-[(2Ε，4Ε，7Ε)-9-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰]四氢吡咯；化合物6 :1-[(2Ε，7Ε)-Ν-7-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰]四氢吡咯；化合物7 :(2E，4E，7E)-N-异丁基-9-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰胺；化合物8:墙草碱；化合物9 : (2E, 7E)-N-异丁基-7-(3,4_次甲二氧基苯)九碳二烯酸胺；化合物10 (2E，4E) -N-异丁基_9_苯基九碳二烯酰胺；
化合物11:大叶筠素；化合物12 (2E，4E)-N_异丁基-11-苯基i^一碳二烯酰胺。其中所述的C18色谱柱包括填料颗粒为5 μ m、2. 6 μ m和1. 7 μ m粒径的色谱柱。所述的二元洗脱系统包括甲醇-水体系，乙腈-水体系以及甲醇乙腈混合液-水体系，洗脱程序可以是梯度也可以是等度。所述的检测波长范围为200-320nm，所述的分析仪器包括HPLC 和 UPLC。 所述HPLC色谱条件为A 色谱柱C18 (5 μ m, 250mmX 4. 60mm)流速1.Oml/min柱温30°C吸收波长216nm,240nm, 259nm流动相
权利要求
1.一种大叶筠中12个酰胺类生物碱的含量测定方法，其特征在于，采用了 C18色谱柱，二元洗脱系统，以及DAD检测器，用于大叶筠及相关产品中以下12个酰胺类生物碱中任意1-12个化合物的同时测定； 化合物1:5'-甲氧基-3'，4'-次甲二氧基桂皮酸四氢吡咯； 化合物2:5」甲氧基-3'，4'-次甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺； 化合物3 :1-[(2Ε，4Ε)-9-(3，4-次甲二氧基苯)七碳二烯酰]四氢吡咯； 化合物4 :(2E，4E)-N-异丁基-9-(3，4-次甲二氧基苯)七碳二烯酰胺； 化合物5 :1-[(2Ε，4Ε，7Ε)-9-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰]四氢吡咯； 化合物6 :1-[(2Ε，7Ε)-Ν-7-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰]四氢吡咯； 化合物7 :(2E，4E，7E)-N-异丁基-9-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰胺； 化合物8 :墙草碱； 化合物9 (2E, 7E) -N-异丁基-7- (3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酸胺； 化合物10 (2E，4E) -N-异丁基-9-苯基九碳二烯酰胺； 化合物11 :大叶筠素； 化合物12 (2E，4E) -N-异丁基-11-苯基i^一碳二烯酰胺。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述的C18色谱柱包括填料颗粒为5 μ m、2. 6 μ m和1. 7 μ m粒径的色谱柱。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述的二元洗脱系统包括甲醇-水体系，乙腈-水体系以及甲醇乙腈混合液-水体系，洗脱程序可以是梯度也可以是等度。
4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述的检测波长范围为200_320nm。
5.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述的分析仪器包括HPLC和UPLC。
6.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述HPLC色谱条件为A 色谱柱C18 (5 μ m，250mmX 4. 60mm) 流速1. Oml/min 柱温30 dC 吸收波长216nm，240nm，259nm 流动相Time (min) 乙腈(%)水(%)O5545206040309010325545375545B 色谱柱C18 (2.6 μ m，100mmX 4.60mm) 流速0. 8ml/min 柱温30°C 吸收波长216nm，240nm，259nm 流动相
7.根据权利要求5所述的含量测定方法，其特征在于所述UPLC色谱条件为C 色谱柱C18 (1. 7 μ m，IOOmmX 2. 10mm) 流速0. 2ml/min 柱温30°C 吸收波长216nm，240nm，259nm 流动相
8.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤I 12个化合物对照品溶液的制备； 步骤2 检测样品溶液的制备； 步骤3 含量测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，经计算得到检测样品中12种化合物的含量。
9.根据权利要求7所述的含量测定方法，其特征在于，其中12个化合物对照品的制备通过以下步骤完成步骤一，提取 取药材胡椒属植物大叶筠的地上部分，粗粉碎，置于提取罐中，加入50-99%的乙醇，回流提取2小时，滤过，药渣用50-99 %的乙醇，回流提取2小时，滤过，合并两次滤液，65 °C减压浓缩成RDl. 3-1. 35的浸膏； 步骤二，粗分离 浸膏用30-60%的乙醇溶解，加入DlOl大孔吸附树脂的色谱柱中，用30-60%的乙醇洗脱，洗脱液弃去，换用60-99%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，得到提取物； 步骤三，纯化制备 提取物经拌样，加入填装有硅胶的色谱柱中，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层法检测，合并同一单点化合物，得到G1-G8，其中Gl经石油醚洗涤，再经乙醇-水体系重结晶得到化合物8 ；G2经Flash快速制备色谱分离，同上重结晶得到化合物10和化合物12 ；G3经石油醚洗涤，再经乙醇-水体系重结晶得到化合物11 ;G4同G3处理之后再经高效制备色谱分离得到化合物7和化合物9 ；G5同G3处理得到化合物4 ；G6同G3处理得到化合物2 ；G7经Flash快速制备色谱分离得到化合物3及化合物5和6的混合物，混合物再经高效制备色谱分离得到化合物5和化合物6 ；G8同G3处理得到化合物I。
10.根据权利要求7所述的含量测定方法，其特征在于，步骤如下 步骤一，12个化合物对照品溶液的制备 分别称取化合物1-12，精密称定，用甲醇配制成1-12号化合物含量分别为90、300、·160、80、90、170、190、120、140、100、90、100μ g/ml 的标准品混和溶液，即为标注储备液，4°C下储存备用。
步骤二，检测样品溶液的制备 称取大叶筠药材粉末或其他大叶筠产品O. 5g，加入25倍量甲醇超声提取3次(500W，·40KHz)，每次20分钟，滤过，用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，待测定。
步骤三，含量测定 将储备液分别按2倍、4倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500、1000倍和10000倍稀释，分别进样10 μ 1，绘制标准曲线和测定最低检测限(LOD)和定量限(LOQ)。
将待测样品进样10μ 1，通过标准曲线分别计算12个化合物的含量。
全文摘要
本发明提供一种同时检测大叶蒟中12个酰胺类生物碱的液相分析方法，该方法包括以下步骤步骤1，12个化合物对照品溶液的制备；步骤2，检测样品溶液的制备；步骤3，含量测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；该方法能够很好的分离12个生物碱并且有效避免了其他杂质的干扰，方法简单、快速、专属性强，稳定性好，可以用于大叶蒟药材及相关产品的质量控制。
文档编号G01N30/88GK103063789SQ201110318120
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者罗学军, 靳元鹏, 张兰兰, 周水平 申请人:天士力制药集团股份有限公司