专利名称：一种有机磷农药多残留金标速测卡的制作方法
技术领域：
本实用新型属于检测技术领域，具体涉及一种可以同时检测二乙氧基硫代磷酸酯类农药和二甲氧基硫代磷酸酯类农药的金标速测卡，可应用水果、蔬菜及环境水样中有机磷农药的快速检测。
技术背景 有机磷农药作为一类高效、广谱的杀虫剂和除草剂广泛应用于农业生产，但其大量使用后在农产品及环境中的残留已经严重危害人畜健康和地球安全。由于有机磷农药种类繁多且复配使用现象普遍，建立可同时检测多个对象的多残留检测方法十分必要。仪器分析方法可以实现多残留检测，但需要昂贵的仪器设备及专业操作人员，且样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足高通量、快速、在线检测的需要。目前，发展快速多残留检测方法成为弥补仪器分析法之不足的重要手段。从20世纪80年起，基于有机磷和氨基甲酸酯类农药抑制胆碱酯酶活性原理而建立的“酶抑制法” 开始被广泛应用于农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速筛查，然而由于其灵敏度及稳定性较差已经逐步退出市场，目前仅中国、韩国等少数发展中国家仍在使用。发展具有更高灵敏度和稳定性的快速检测方法迫在眉睫。基于抗原抗体特异性结合反应的免疫分析法具有灵敏度与常规的仪器分析一致，适合现场筛选，简单、快速、成本低、样品所需量少、前处理简单方便等优点，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的超微量检测技术。金标免疫层析是将胶体金直接标记在抗体分子上，利用免疫层析原理进行测定的方法。其操作简便快速，几分钟即可看到结果，成本也非常低廉。目前的发展趋势为制备更加灵敏、快速与同时可以进行多残留检测的金标试纸。目前基于金标原理的有机磷农药多残留速测卡国内外很少报道，在同一个速测卡上可同时检测两类有机磷农药尚未见报道。
发明内容本实用新型的目的在于克服现有技术的不足，提供一种有机磷农药多残留速测卡，可以实现同时、简便、快速地检测食品和环境中的二乙氧基硫代磷酸酯和二甲氧基硫代磷酸酯类有机磷农药。本发明目的通过以下技术方案予以实现本实用新型提供一种有机磷农药多残留金标免疫速测卡，包括底板和封盖板，以及至少两组依次粘贴的缓冲垫、样品垫、金垫、检测膜、吸水垫；所述缓冲垫一面粘贴在底板上，缓冲垫另一面粘贴样品垫，样品垫上依次粘贴金垫、检测膜、吸水垫；依次粘贴好后盖上所述封盖板即得所述速测卡。所述封盖板上设有加样孔和可视窗，所述加样孔对着缓冲垫，所述可视窗分别对着检测膜；所述检测膜上表面并列包被有有机磷农药抗原和羊抗鼠 IgG，分别形成检测线和质控线。优选地，所述缓冲垫为一个整体，横跨两个的样品垫，所述加样孔对着缓冲垫正中间。[0009]所述底板采用不吸水的塑料板，塑料板一面涂有不干胶，底板起固定支持试纸其他组成部分的作用。缓冲垫和样品垫采用滤纸或玻璃纤维纸，所述缓冲垫和样品垫是将滤纸或玻璃纤维纸浸入0. lmol/L、pH6. 4 7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)中2 5min，取出后于8 0°C烘干或真空干燥或其他方式干燥即得。所述金垫是采用玻璃纤维纸或滤纸，将玻璃纤维纸或滤纸分别浸入二乙氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体溶液和二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体溶液中，优选4°c 下搅拌浸泡2h。所述二乙氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体溶液参考技术文献Xu et al. Analytical Chemistry, 2010，82，9314 - 9321 中的描述。所述二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体溶液参考技术文献李永祥等，分析化学，2010，38(11): 1550-1555多克隆抗体(PAb-H3)中的描述结合常规方法制备。所述检测膜粘贴在金垫上；所述吸水垫优选玻璃纤维纸、滤纸或吸水纸。本实用新型检测原理通过加样孔加入样品，样品通过缓冲垫到达样品垫，接着上移到金垫。如果样品中含有有机磷农药，会与金垫上的有机磷农药抗体结合继续上移到检测线，因为胶体金标记的有机磷农药抗体只有一个结合位点，样品中的有机磷农药与之结合之后，检测线上的有机磷农药抗原就不能再与胶体金标记的抗体结合，于是检测线(T)无色；当样品中没有有机磷农药时，胶体金标记的抗体到达检测线(T)时被检有机磷农药抗原(6-(( 二乙氧基硫代磷酸基)氨基)己酸与卵清蛋白(OVA)的偶联物)捕获，则形成肉眼可见红色。无论样品中是否含有有机磷农药，质控线(C)都会出现红色。因此，如果样品中只含有二乙氧基硫代磷酸酯类农药，上面检测膜上只有一条红线；如果样品中只含有二甲氧基硫代磷酸酯类农药，下面检测膜上只有一条红线；如果两种农药都有时，上面检测膜和下面检测膜都只有一条红线。当样品中不含有上述两类有机磷农药时，上面检测膜和下面检测膜都有两条红线。本实用新型的有益效果(1)广谱特异性好。本实用新型速测卡采用具有广谱特异性的二乙氧基硫代磷酸酯类农药和二甲氧基硫代磷酸酯类农药的单克隆抗体，分别对两类农药有很好的识别性能。(2)本实用新型操作简单，可以快速同时检测样品中10个二乙氧基硫代磷酸酯类农药和8个二甲氧基硫代磷酸酯类农药，分别达到0. 001 0. 693mg/kg和0. 026 1. Omg/
kg ο(3)高通量。可实现对二乙氧基硫代磷酸酯类农药和二甲氧基硫代磷酸酯类农药两类农药的同时检测。(4)操作简单方便。对水果、蔬菜及环境水样品进行简单处理后即可检测。本速测卡不需任何仪器设备，普通非专业人员都可操作，用肉眼即可判读。(5)速度快，颜色稳定，滴加样品3 5min以后便可观察结果，检测限和质控线的颜色可保持30min以上，适合于对蔬菜、水果和环境水样中的有机磷农药进行快速检测。
图1本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来进一步详细说明本实用新型。实施例1(1)本实用新型的结构
如附图1所示，本实用新型提供了一种有机磷农药多残留金标速测卡，包括底板1 和封盖板9，两组缓冲垫2、样品垫3、金垫4、检测膜5和吸水垫8 ；所述样品垫3、金垫4、检测膜5和吸水垫8依次粘贴在底板上；附图1所示是本实用新型优选的技术方案，所述缓冲垫2横跨两个样品垫3上；所述检测膜3上表面并列包被有有机磷农药抗原(检测线6)和羊抗小鼠IgG (质控线7)。本实用新型所描述的试纸的各部分的功能与制备方法描述如下底板1 为一面涂有不干胶的不吸水的塑料板，起固定支持速测卡其他组成部分的作用并与封盖板9合并成速测卡。缓冲垫2和样品3 将玻璃纤维纸浸入pH 6. 4 7. 2的Tris-HCl中5min，取出， 真空干燥，即得缓冲垫2和样品垫3。缓冲垫2和样品垫3在检测时起吸收样品溶液的作用，样品溶液通过缓冲垫2平均分到两个样品垫3上，并形成向上移动。金垫4 起固定胶体金标记的抗体的作用。金垫4的制备和处理包括胶体金溶胶制备、胶体金标记有机磷农药抗体和金垫处理三个步骤胶体金溶胶制备将氯金酸(HauCl4)用超纯水配置成1%的母液，取ImL的母液， 用超纯水定容到IOOmL,配成0. 01%的溶液，加热至沸腾，加入一定量的1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，即得胶体金溶胶；胶体金标记有机磷农药单克隆抗体制备将有机磷农药单克隆抗体(Xu et al. Analytical Chemistry, 2010，82，9314 - 9321)用 Tris-HCl (0.01mol/L，ρΗ8· 0)溶解稀释至3mg/mL，每IOmL胶体金溶胶加入0. ImL 2 mg/mL的有机磷农药单克隆抗体，涡旋 5min，加入 10% PEG-20000 2mL, 15000r/min 离心 15min,除去上清，用 Tris-HCl (0. Olmol/ L, ρΗ7· 4)复溶，以 10000 r/min 离心 15 min,除去上清，将沉淀用 Tris-HCl (0. 01mol/L, pH7. 4)稀释1000倍，产物作为金标有机磷农药单克隆抗体；金垫处理将金标有机磷农药单克隆抗体倒入干净的烧杯中，玻璃纤维纸或滤纸浸入lmin，取出，真空冷冻干燥即为金垫4。检测膜5 检测膜5上包被1条有机磷农药抗原(李永祥等，分析化学，2010， 38(11) 1550-1555中的半抗原H7与卵清蛋白(OVA)的偶联物)作为检测线6，包被1条的羊抗鼠IgG线作为质控线7，有机磷农药抗原可以被两种抗体同时识别。吸水垫8 采用室温干燥后的玻璃纤维纸、滤纸或吸水纸作为吸水垫。吸水垫8主要作用在于将移动上来的样品溶液吸收。封盖板9 塑料板上面有加样孔10和可视窗11，可以与底板1结合形成检测卡。本实用新型的组装，如附图1所示，在底板1上依次粘贴两组样品垫3、金垫4、检测膜5和吸水垫8，将缓冲垫1横跨在两个样品垫上，然后将封盖板9盖上，加样孔10对着缓冲垫正中间，两个可视窗11分别对着两个检测膜5。[0039](2)本实用新型的应用 环境水样的检测直接吸取环境水样滴加到加样孔10中，滴加4滴，静置平放3 5min后。若两个检测膜都呈现颜色，表明样品为阴性，不含二乙氧基硫代磷酸酯类或二甲氧基硫代磷酸酯类有机磷农药，否则为阳性样品。无论样品为阴性或阳性，质控线应该显色， 若质控线不显色，表明试纸失效。水果蔬菜样品的检测水果(取皮部分)或蔬菜切成小块，称取Ig用ImL 0. 05mol/ L含10%甲醇的PBS溶液提取10 min, 5000 rpm离心5min，取上清直接检测，方法及判断结果同环境水样。本实用新型的对有机磷农药的检测限如表1所示。表1本速测卡对有机磷农药的检出限(mg/kg)
权利要求1.一种有机磷农药多残留金标速测卡，其特征在于包括底板和封盖板，以及至少两组依次粘贴的缓冲垫、样品垫、金垫、检测膜、吸水垫；所述缓冲垫一面粘贴在底板上，缓冲垫另一面粘贴样品垫，样品垫上依次粘贴金垫、检测膜、吸水垫；所述封盖板上设有加样孔和可视窗，所述加样孔对着缓冲垫，所述可视窗分别对着检测膜；所述检测膜上表面并列包被有有机磷农药抗原和羊抗鼠IgG，分别形成检测线和质控线；所述金垫分别经浸入胶体金标记的二乙氧基硫代磷酸酯类农药多特异性单克隆抗体溶液和胶体金标记的二甲氧基硫代磷酸酯类有机磷农药多特异性单克隆抗体溶液中处理。
2.根据权利要求1所述的有机磷农药多残留金标速测卡，其特征在于所述缓冲垫为一个整体，横跨两个样品垫；所述封盖板只有一个加样孔，所述加样孔对着缓冲垫正中间。
3.根据权利要求1所述有机磷农药多残留金标速测卡，其特征在于缓冲垫和样品垫分别为浸入0. lmol/L、pH6. 4 7. 2的PBS缓冲液中处理的滤纸或玻璃纤维纸。
4.根据权利要求1所述有机磷农药多残留金标速测卡，所述金垫为玻璃纤维纸。
5.根据权利要求1所述有机磷农药多残留金标速测卡，所述检测膜上表面并列包被有有机磷农药抗原为6-(( 二乙氧基硫代磷酸基)氨基)己酸与卵清蛋白OVA的偶联物。
专利摘要本实用新型公开了一种有机磷农药多残留金标速测卡，包括底板和封盖板，以及至少两组依次粘贴的缓冲垫、样品垫、金垫、检测膜、吸水垫；所述缓冲垫粘贴在底板上，所述缓冲垫上横跨粘贴至少两个的样品垫，样品垫上依次粘贴金垫、检测膜、吸水垫；所述封盖板上设有加样孔和可视窗，所述加样孔对着缓冲垫，所述可视窗分别对着检测膜；所述检测膜上表面并列包被有有机磷农药抗原和羊抗鼠IgG，分别形成检测线和质控线。本实用新型操作简单、快速，可以快速同时检测样品中10个二乙氧基硫代磷酸酯类农药和8个二甲氧基硫代磷酸酯类农药，灵敏度分别达到0.001～0.693mg/kg和0.026～1.0mg/kg，3～5分钟即可观察结果，适合于对蔬菜、水果和环境水样中的有机磷农药进行快速检测。
文档编号G01N33/552GK202216956SQ20112010559
公开日2012年5月9日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者孙远明, 徐振林, 杨金易, 沈玉栋, 王弘, 雷红涛 申请人:华南农业大学