用于确定lrrk2抑制剂的试验的制作方法

专利名称：用于确定lrrk2抑制剂的试验的制作方法
用于确定LRRK2抑制剂的试验
本发明涉及用于评估LRRK2抑制剂的试验。
编码富亮氨酸重复序列蛋白激酶_2 (LRRK2)的基因中的常染色体显性错义突变使人类易于患帕金森氏病[1，2]。LRRK2突变的患者通常患有帕金森氏病，其临床表现和症状不易区分于60-70岁左右的自发性帕金森氏病[3]。LRRK2突变占家族性帕金森氏病的 4%，并在1%的散发性帕金森氏病患者中观察到LRRK2突变[3]。
LRRK2是一种较大的酶(2527个残基)，其由富亮氨酸重复序列(残基1010-1287)、 GTP酶结构域(残基1335-1504)、C0R结构域(残基1517-1843)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域(残基1875-2132)和WD40重复序列(残基2231-2276)构成[4]。已报导了超过40种错义突变[5]。在之前的工作中，已使用各种类型的重组LRRK2对LRRK2的突变型亚群的活性以及定位进行分析，所述的各种类型的重组LRRK2使用多种方法表达和测定[4，32]。 最常见的突变包括位于激酶结构域的亚结构域VII-DFG基序的高度保守的Gly2019进行氨基酸取代成Ser残基[5]，使LRRK2的蛋白激酶活性提高约2倍[6]。该发现表明LRRK2 的抑制剂可用于治疗帕金森氏病。也报导了在分散的细胞溶质池中蓄积的各种突变体如 LRRK2[R1441C]和LRRK2 [Y169 9C]，认为其由错误折叠的蛋白聚集体构成[6]。
在采用肽底物如LRRKtide[7]或Nictide[8]的试验中，可容易地在体外测定 LRRK2固有的蛋白激酶催化活性；这还参见WO 2008/122789和PCT/GB2009/002047。这使得有可能进行筛选以确定抑制剂。最近的工作表明广泛分布的称为H-1152的Rho-激酶 (ROCK)抑制剂也以相似的效价抑制LRRK2 (IC5tl为150nM) [8]。用于治疗肾细胞癌和其它癌症的多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼(商品名索坦，也称为SU11248)最近被证实可抑制LRRK2 (IC50为20nM)[8-10]。我们还发现H-1152和舒尼替尼对LRRK2 [G2019S]突变体的抑制比野生型LRRK2强两到四倍[8]。根据LRRK2激酶结构域的分子模拟，我们设计了耐药性LRRK2[Ala2016Thr]突变体，其具有正常活性，但对H-1152的敏感度降低32倍，对舒尼替尼的敏感度降低12倍[8]。
由于对于LRRK2是如何被调节的以及其底物是什么了解甚少，因此开发LRRK2抑制剂的瓶颈是如何评估这些化合物在体内的相对有效性。我们提供了可用于在基于细胞的系统中评估的LRRK2抑制剂的方法。我们证明了 LRRK2激酶活性调节邻近富亮氨酸重复序列结构域的两个N-端残基(Ser910和Ser935)的磷酸化，所述的磷酸化介导与磷适体 14-3-3蛋白的结合[11]。与此一致的是，H-1152和舒尼替尼诱导Ser910和Ser935的去磷酸化，从而破坏14-3-3与野生型LRRK2和LRRK2 [G2019S]的相互作用，但未破坏其与耐药性LRRK2[Ala2016Thr]突变体的相互作用。我们提供的证据表明破坏14_3_3的结合诱导LRRK2在胞质池中蓄积，这表现为与之前报导的LRRK2[R1441C]和LRRK2[Y1699C]突变体的胞质池相似。Ser910和Ser935的磷酸化或14_3_3结合，或LRRK2的亚细胞定位，可用于监测LRRK2抑制剂的效果。
本发明的第一个方面提供了用于评估试验化合物在基于细胞的系统中对LRRK2 的作用的方法，所述方法包括步骤
a)评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物对LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化状态的作用；和/或
b)评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物对LRRK2与14_3_3多肽结合的作用。
在某些实施方案中，该方法可包括或进一步包括评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的亚细胞定位的作用的步骤。
所述方法可进一步包括选择认为对基于细胞的系统中的LRRK2具有抑制作用的化合物的步骤，其中如果LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化在暴露后降低；和/或 LRRK2与14-3-3多肽的结合在暴露后降低，则选择该试验化合物。
所述的试验化合物一般地可以是选作可能的LRRK2抑制剂的化合物，例如通过体外试验选择的，所述的体外实验例如使用LRRKtide或Nictide作为LRRK2底物多肽的试验。适合将化合物选作LRRK2的可能抑制剂的试验的实例描述于例如WO 2008/122789和 PCT/GB2009/002047 中。
一般地，Ser910的磷酸化是使用特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体来评估的。
一般地，Ser935的磷酸化是使用特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser935未磷酸化的L RRK2的抗体来评估的。
特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体是指与Ser910磷酸化的LRRK2结合， 而不与Ser910未磷酸化的LRRK2或其它磷酸化的丝氨酸残基结合的抗体结合。类似地，特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体不与Ser935未磷酸化的LRRK2或其它磷酸化的丝氨酸残基结合。广泛结合于磷酸化的丝氨酸残基的抗体不是特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体。
类似的考虑也适用于特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser935未磷酸化的LRRK2的抗体。特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体不与Ser910磷酸化的LRRK2结合。特异性结合于Ser935未磷酸化的LRRK2的抗体不与 Ser935磷酸化的LRRK2结合。
产生和使用这种抗体的方法对于本领域技术人员是显而易见的。在实施例中描述了这种抗体和生成及使用它们的方法的实例。所述的抗体可为多克隆或单克隆的。
例如，如本领域技术人员所熟知，ELISA类型的试验可以是特别有用的。
可通过用于评估蛋白蛋白相互作用的任何合适适用的技术来评估LRRK2与 14-3-3多肽的结合。如以下进一步讨论的，一般地可以通常使用FRET (荧光共振能量转移)技术。其它可能有用的技术可利用免疫沉淀技术。例如，对于本领域技术人员是显而易见的，免疫沉淀可使用特异性结合于LRRK2的抗体进行免疫沉淀；或可使用特异性结合于 14-3-3多肽的抗体进行，其对于本领域技术人员是显而易见的。本领域技术人员熟知特异性结合于14-3-3多肽的抗体对于本领域技术人员是熟知的，并且从商业上可得到该抗体有市售。另外，对于本领域技术人员是显而易见的是，免疫沉淀可使用与重组LRRK2上存在的标记特异性结合的抗体来进行免疫沉淀；或使用与重组14-3-3多肽上存在的标记特异性结合的抗体进行，其对于本领域技术人员是显而易见的。
例如，认为可使用Invitrogen的Alpha-Elisa技术将磷酸/去磷酸-LRRK检测和 14-3-3共拉下(co-pull down)或抗LRRK2抗体(非磷酸化状态依赖性)进行结合，这可用于实现高通量筛选系统。也可使用利用基于电化学发光的Luminex珠或板检测(MSD ；meso scale discovery)的多重检测。
可应用于蛋白蛋白和磷酸蛋白检测的Alpha screen技术(Perkin Elmer)(针对MAPK，JAK/STAT和AKT途径开发和销售的Sure fire试剂盒)的详细内容可见于，例如
http://las. perkinelmer. c ο . uk / Catalog / CategoryPage. htm CategoryID=AlphaTech&M=BIO
可应用于磷蛋白检测和蛋白蛋白和总蛋白定量的Luminex技术的详细内容可见于，例如 http://www. luminexcorp. com/appIications/ceIlularsignaling, html
在参考文献Khan IH, Zhao J. , Ghosh, P. Ziman, M. , Sweeney C, Kung HJ 和 Luciw PA(2010)Assay Drug Dev technology 8，27-36 中描述了该技术的使用的实例。
在MSD技术中，捕获至板的表面以及抗体检测的原理与任何ELISA相同，但检测模式使用了通过钌标记的探针的电化学发光，并且该技术使得能够通过阵列格式在孔中进行多重检测。
http : //www. mesoscale. com/CatalogSystemffeb/ffebRoot/literature/ brochures/pdf/tech Brochure. pdf
可以使用基于细胞培养中定量稳定同位素标记氨基酸(SILAC)的质谱来确定和定量与LRRK2 (或14-3-3多肽)的免疫沉淀相关的蛋白。也可使用其它免疫沉淀方法，如本领域技术人员所熟知的那些。例如可使用洋地黄毒苷标记的14-3-3多肽。实施例中描述了该方法的一些实例。如上所述，也可使用用于评估细胞或细胞提取物中的蛋白蛋白相互作用的其它技术。例如，如果对重组LRRK2和重组14-3-3多肽的相互作用进行评估，例如如果LRRK2和14-3-3多肽两者均标记有荧光多肽，可使用基于荧光共振能量转移(FRET) 的系统。
因此，可使用基于FRET的方法，例如在显微镜上如多光子纤维镜上进行的 FLIM-FRET来研究LRRK2和14_3_3之间的相互作用(和试验化合物的作用)。例如，将用于表达Cherry标记的野生型14_3_3同工型或(作为对照)不结合于磷酸靶点的Cherry标记的14-3-3同工型的非活性突变体如14-3-3 ζ [Ε180Κ]的构建体转染至稳定表达野生型 GFP-LRRK2 或(作为对照)GFP-LRRK2[S910A/S935A]的细胞系中。当通过 LRRK2 与 14_3_3 结合而使GFP和mCherry突光团结合并转而影响其突光寿命时,可发生FRET (突光共振能力转移)，能够对其进行检测。通过使用FUM，我们能够(荧光寿命成像显微术)生成细胞的空间分布，其中可确定较强的蛋白-蛋白相互作用(并且从而发生FRET)和较弱的相互作用或无相互作用(通过颜色编码参见例如LiSres等人,2009 Quantitative analysis of chromatin compaction inliving cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 2009Nov 16; 187(4) :481-96.)。在 GFP-LRRK2 [S910A/S935A]和 mCherry-14-3-3 之间或在野生型 GFP-LRRK2和非活性14_3_3多肽之间不应观察到FUM-FRET。
常用的FRET对包括CFP (供体)和YFP (受体)以及GFP (供体)和Cherry (受体)。在供体和受体荧光团均可被相同激发光波长激发的情况下，例如，在FRET对GFP-YFP 的情况下，可检测到称为增强型受体荧光(EAF)的特殊类型的FRET。涉及FRET技术的更多参考文献的实例包括 Wallrabe &Periasamy (2005) Current Opinion in Biotechnology Volume 16，Issue I, February 2005, Pages 19—27;Imaging protein molecules usingFRET and FLlMmicroscopy ；Ai 等人(2008)Nature Methods 5,401-403 Fluorescent proteinFRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors ；Shaner 等人.(2004)NatBiotechnol 22:1567 - 1572 Improved monomeric red,orange and yellowfluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein。
对将包含LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物对LRRK2的Ser910和/或 Ser935的磷酸化状态的作用的评估；和/或对将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物对LRRK2与14-3-3多肽结合的作用的评估可通过评估LRRK2的亚细胞定位来进行 (或进一步评估)。认为降低Ser910和/或Ser935的磷酸化，和/或降低LRRK2与14_3_3多肽的结合可使胞质池中存在的LRRK2多肽的量升高(而不是广泛位于整个细胞质中XLRRK2 的亚细胞定位可使用本领域技术人员熟知的技术评估，所述的技术例如使用免疫组织化学或荧光显微镜，例如使用具有荧光蛋白(例如GFP)标签的重组LRRK2多肽。实施例中给出了该技术的实例。
在一个实施方案中，本发明所述方法可包括或进一步包括评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的亚细胞定位的作用的步骤。
所述的基于细胞的系统可为体外的细胞系统。例如，可对细胞系进行试验。认为合适的细胞系的实例包括Swiss 3T3细胞或HEK-293细胞。其它合适的细胞包括例如EBV 转化淋巴样干细胞，其来自表达野生型LRRK2的人类对象，或来自LRRK2[G2019S](或与帕金森症相关的其它LRRK2突变体)纯合的人类对象。也可使用神经元细胞系。合适的细胞系也可为表达重组LRRK2和/或重组14-3-3多肽的细胞系。如实施例中所描述的,认为用于该表达的合适细胞包括T-Rex细胞。如本领域技术人员所熟知的，细胞，例如T-Rex细胞会以可诱导的方式表达重组LRRK2或重组14-3-3多肽。例如，如就像实施例中所描述的， 可通过培养基中的多西环素内含物诱导细胞表达所需的重组多肽。
14-3-3多肽通常为或包括人β、η、θ、ζ、γ或ε同工型。优选地，14-3-3多肽不完全为人σ同工型。14-3-3多肽序列的实例显示如下。技术人员能够在数据库中容易地确定其它14-3-3多肽序列。例如，可使用NCBI数据库的Homologene特征。
人14-3-3 β
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如本领域技术人员所公知的，所述的14-3-3多肽可包括标记序列。例如，可使用在FRET系统中有用的标签。可使用例如荧光蛋白标签，例如Cherry标签。与通常认为的 14-3-3多肽与磷酸化多肽结合的情况一样，认为当结合于LRRK2多肽时，14-3-3多肽可为二聚体的形式(通常为同源二聚体)。14-3-3多肽通常为全长14-3-3多肽。
例如就像在实施例中所述的，重组LRRK2可为标记了例如荧光多肽部分的LRRK2， 所述的荧光多肽部分例如GST部分或绿色荧光蛋白(GFP)部分或FLAG部分。LRRK2多肽可为野生型LRRK2或可为LRRK2突变体，例如LRRK2 [G2019S]。LRRK2通常不具有耐药性 A2016T突变。通常LRRK2不是无激酶活性的突变体。LRRK2通常在910位和935位上具有丝氨酸残基(全长野生型LRRK2的编号)。这些丝氨酸残基周围的序列与野生型LRKK2相比通常未改变。特别地，在图3G上标出的残基通常被保留，即_3和-4位上的碱性残基，-2位上的Ser残基，-I位上的Asn和+1位上的大的疏水残基。通常所述的LRRK2为全长LRRK2。
LRRK2具有耐药性A2016T突变的对照细胞是有用的。LRRK2在910和935位(全长野生型LRRK2的编号)的一个或者两个上具有突变(例如丙氨酸突变)的对照细胞是有用的。LRRK2为激酶无活性突变体的对照细胞也是有用的。
稳定表达FLAG或GST标记的LRRK2的细胞系可以是尤其有用的。表达能够进行 FRET的标记荧光标记的LRRK2和14_3_3多肽的细胞系可以是有用的。FRET供体-受体对的实例对本领域技术人员是公知的，并在前文中给出了一些实例。例如LRRK2可标记GFP 部分而14-3-3多肽可标记Cherry部分。
神经元细胞或血液细胞系也可以是特别有用的。内源性表达LRRK2的任何细胞系也是有用的。
LRRK2通常为人LRRK2，但也可以是其它哺乳动物的LRRK2，例如认为在评估LRRK2 的潜在抑制剂中有用的实验动物或组织或器官试验系统的LRRK2。因此，所述的LRRK2可为实验室啮齿动物的LRRK2 (例如小鼠、兔或大鼠)或可为实验室灵长类动物的LRRK2，例如猴 LRRK2。本发明所述试验可例如用于评估试验化合物对实验动物脑组织中LRRK2的作用，所述的实验动物例如小鼠或猴。
LRRK2多肽可以是具有野生型人LRRK2天然突变的人LRRK2 ;或其融合体。人 LRRK2的所述天然突变可以是与帕金森氏病(PD)相关的突变。如上所述，使用野生型人 LRRK2的编码时，所述的突变可以是G2019S。如在上文的Jaleel等人(2007)或在上文PCT/ GB2008/001211中进一步讨论的，认为该突变可提高LRRK2的蛋白激酶活性。
使用野生型人LRRK2的编码时，所述的突变可以是R1441C、R1441G、Y1699C、 R1914H、I2012T、I2020T 或 G2385R。认为具有 R1441C、R1441G、Y1699C 或 T2356I 突变的 LRRK2具有与野生型LRRK2相似的蛋白激酶活性。认为具有R1914H或I2012T突变的LRRK2 几乎失活。认为具有R1441C或Y1699C突变的LRRK2在胞质池中蓄积(而不是广泛存在于整个细胞质中)的程度比野生型LRRK2更高。认为具有I2020T突变的LRRK2的活性介于野生型LRRK2和具有R1914H或I2012T突变的LRRK2之间。也认为具有G2385R突变的LRRK2 几乎失活。其它突变体的活性如上文的PCT/GB2008/001211的图17所示。
将化合物对一个以上的LRRK2多肽进行测试可以是有帮助的；例如对一个以上的突变LRRK2多肽测试。这可以有助于确定待设计和测试的其它化合物。
特别优选地，虽然不是必需的，但对于全长人膜突蛋白在残基Thr558或Thr526上的磷酸化，或包括这样的残基(例如RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR)的肽底物或RLGffffRFYTLRRARQGNTKQR的磷酸化，LRRK2多肽的酶活性至少为全长人LRRK2的30%。 更优选的是，对于全长人膜突蛋白在残基Thr558或Thr526上的磷酸化；或包括如上所述的这样的残基的肽底物的磷酸化；或RLGffffRFYTLRRARQGNTKQR的磷酸化，LRRK2多肽的酶活性至少为全长人LRRK2的50%，优选至少70%，更优选至少90%。
在NCBI数据库中，哺乳动物LRRK2序列的登录号包括
AAV63975. I 人
ΧΡ_001168494· I 黑猩猩(Pan troglodytes),(黑猩猩)
ΧΡ_615760· 3 牛(Bos Taurus)(家牛)
ΧΡ_543734· 2 家犬(Canis familiaris)(家犬)
ΝΡ_080006· 2 小鼠(Mus musculus)(小鼠)
ΧΡ_235581· 4 大鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)
如本领域技术人员所公知，可在通过NCBI MedlineTM服务进入的序列数据库中访问哺乳动物和非哺乳动物LRRK2多肽序列的许多其它实例。
多肽的“变体”包括保守或非保守的插入、删除和替换。特别地，包括多肽的变体， 其中该变化视情况地不在实质上改变蛋白激酶活性或被磷酸化的能力或LRRK2和14-3-3 多肽之间的相互作用。根据例如每种多肽实例的序列比较，技术人员应能够容易地设计并测试合适的变体，所述多肽例如是来自不同物种的。技术人员应能够容易地确定在何处可进行插入或删除；或哪一个残基可适当地保持不变；以保守替换进行取代；或以非保守替换进行取代。可容易地测试变体多肽，例如如实施例中所述的实例。
“保守替换”是指预定组合如 Gly、Ala ;Val、Ile、Leu ;Asp、Glu ;Asn、Gln ；Ser>Thr ； Lys > Arg ;和 Phe、Tyr。
除了定义如上的符号Zaa，本文使用IUPAC-IUB生物化学命名委员会的三字母或单字母氨基酸编码。特别地，Xaa代表任意氨基酸。优选的是，至少地对应于本文所定义的共有序列的氨基酸优选为L-氨基酸。
特别优选地，多肽变体的氨基酸序列与相关人类多肽的氨基酸序列有至少65%同源性，更优选与相关人类多肽的氨基酸序列至少70%、71%、72%、73%或74%，仍更优选至少 75%，还更优选至少80%，进一步优选至少85%，仍进一步优选至少90%，最优选至少95%或 97%同源性。
进一步优选地，蛋白激酶变体的氨基酸序列与人类多肽的催化结构域的氨基酸序列有至少65%的同源性，更优选与相关人类多肽的氨基酸序列至少70%、71%、72%、73%或 74%,仍更优选至少75%,还更优选至少80%,进一步优选至少83%或85%,仍进一步优选至少 90%，最优选至少95%或97%同源性。
应当认识到本领域技术人员能够例如使用以下描述的序列比较，容易地确定蛋白激酶相关的多肽的催化结构域。蛋白激酶显示有保守的催化核心，如Johnson等人(1996) Cell, 85，149-158 和 Taylor & Radzio-Andzelm(1994) Structure 2，345-355 所综述的那样。该核心折叠成主要包括反平行折叠的较小N-端叶(lobe)，和主要为α-螺旋的较大C端叶。
使用合适的计算机程序可测定两个多肽之间的序列百分比同源性，所述的程序例如威斯康辛大学遗传计算组的GAP程序，并且应当认识到百分比同源性的计算与进行了序列最佳比对的多肽有关。
可选地,可使用Clustal W程序(Thompson等人，1994)进行比对。所使用的参数如下
快速双序列比对(fast pairwise alignment)参数K-串(词)大小；1，窗口大小；5,空位罚分(gap penalty) ；3,顶端对角线数(number of topdiagonals) ；5.评分法百分之X。
多序列比对参数(multiple alignment parameters):空位开放罚分(gapextenxion penalty) ；10,空位延伸罚分；O. 05。
记分矩阵BL0SUM
可选地，所述的比对可以使用程序T-Coffee或EMBOSS进行。
通过使序列之间的匹配度最大化的方式，将多肽序列与全长人LRRK2的序列相比对，可确定与例如全长人LRRK2的Ser910相对应(等价)的残基。所述的比对可以通过目测和/或使用合适的计算机程序进行，所述的程序例如威斯康辛大学遗传计算组的GAP 程序，所述程序也可计算多肽的百分比同源性。比对程序(Pearson (1994) in:Methods in MolecularBiology, Computer Analysis of Sequence Data, Part II(Griffin, AM 和 Griffin, HGeds)pp365-389, Humana Press, Clifton)。因此，以这种方式确定的残基也为 “相应的残基”。
应当认识到在(例如)LRRK2的截短形式或氨基酸发生简单替换的形式的情况下， 容易确定“相应的残基”。
优选地，用于筛选的多肽为哺乳动物的，优选人类的(或用于农业或用作驯化或伴侣动物的物种，例如犬、猫、马、牛)，包括天然存在的等位变体(包括剪接变体)。如本领域技术人员所知的，或如上所述或在实施例中所描述的，在筛选中使用的多肽可包括GST部分或可为生物素化的或另外地标记的，例如以6His、HA、myC或其它表位标记的。这可用于纯化和/或检测多肽(或多种多肽)。
可通过在不同浓度的化合物存在下，比较残基Ser910或Ser935的磷酸化，或 14-3-3多肽的结合，或LRRK2的亚细胞定位来测定化合物的作用，所述的不同浓度的化合物例如在化合物不存在和存在下，例如在浓度约为100 μ Μ、30 μ M、10 μ Μ、3 μ M、I μ M、 O. I μ Μ、0· 01 μ M 和 / 或 O. 001 μ M 下。
比较试验化合物的作用与认为是LRRK2抑制剂的化合物的作用可以是有用的，所述认为是LRRK2抑制剂的化合物为例如H-1152和/或舒尼替尼。
基于细胞的系统可为离体细胞系统。所述的细胞可为组织或器官样品的形式。所述的样品可以是血液、肾脏、脑或脾脏(或高度表达LRRK2的其它组织)。
基于细胞的系统可为体内系统。例如可在试验动物中将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物。本领域技术人员公知将试验动物暴露于试验化合物的合适方式。 通常该化合物可以经制剂用于通过注射给予或口服给予，但对于技术人员而言显而易见的是，可使用其它给予途径。可通过侵入性、微创或无创技术从试验动物中获得用于分析的样本。例如，可分析血液样品(微创)；或脑组织样品(侵入性)，这需要处死动物。
可对取自试验动物的细胞进行LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化状态的评估；和/或LRRK2与14-3-3多肽结合的评估和/或LRRK2的亚细胞定位的评估。例如，取自试验动物的细胞可为取自试验动物血液的细胞。
所述的基于细胞的系统可为基于淋巴样干细胞的系统。淋巴样干细胞可存在于试验动物的血液样本中。巨噬细胞系(例如RAW细胞系)的系统可能是有用的。利用来自人志愿者血液的巨噬细胞的系统也可能是有用的。
认为该方法可用于确定化合物，所述化合物调节，例如抑制，基于细胞的系统中的 LRRK2的蛋白激酶活性(或Ser910和/或Ser935的磷酸化，或LRRK2和14_3_3多肽间的相互作用，或LRRK2在胞质池中的蓄积)。调节例如抑制基于细胞的系统中的LRRK2的蛋白激酶活性(或Ser910和/或Ser935的磷酸化，或LRRK2和14_3_3多肽间的相互作用，或 LRRK2在胞质池中的蓄积)的化合物可用于帕金森氏病(例如自发性帕金森氏病或迟发性帕金森氏病)或帕金森症(Parkinsonism)的治疗。
调节，例如抑制基于细胞的系统中的LRRK2的蛋白激酶活性(或Ser910和/或 Ser935的磷酸化，或LRRK2和14_3_3多肽间的相互作用，或LRRK2在胞质池中的蓄积)的化合物也可用于其它神经退行性疾病。
所述的化合物可为结合于LRRK2多肽和底物多肽之间的接触区域或者结合于 LRRK2多肽和底物多肽之间的接触区域附近的化合物，或为结合于另一个区域并且例如诱导稳定(或破坏)复合物的构象或变构变化；或是促进(或抑制)其形成的化合物。所述的化合物可结合于LRRK2多肽或底物多肽，以通过变构效应提高LRRK2多肽的蛋白激酶活性。该变构效应可为在LRRK2多肽活性的天然调节中所涉及的变构效应。
在该方法中确定的化合物本身可用作药物，或其可代表先导化合物，用于设计和合成更为有效的化合物。
对于上述确定化合物的每种方法，化合物可为类药化合物或用于开发类药化合物的先导化合物。应当认识到所述方法可用作如本领域技术人员所公知的药物化合物或药物开发中的筛选试验。
术语“类药化合物”对于本领域技术人员来说是熟知的，其可包括具有使其适合用于药品的性质的化合物的含义，例如使其适合用作药物中的活性成分。因此，例如，类药化合物可为通过有机化学技术合成的分子，较不优选地通过分子生物学或生物化学技术合成，并且其优选为小分子，所述小分子可以是小于5000道尔顿的。类药化合物可以附加地显示出与一种特定的蛋白或多种蛋白选择性作用的特征，并且为可生物利用的和/或能够穿透细胞膜，但应当认识到这些特征不是必需的。
术语“先导化合物”对于本领域技术人员是类似地熟知的，其可包括的含义是该化合物虽然自身不适合用作药物(例如由于其对预定的靶仅具有微弱作用、其作用无选择性、 不稳定、难以合成或生物利用度差)，但可为其它具有更满意的性质的化合物提供设计起
应当理解的是，希望确定能够调节体内蛋白激酶活性的化合物。因此应当理解的是，可这样选择在该方法中使用的试剂和条件，以使例如LRRK2多肽和底物多肽之间的相互作用与人LRRK2和内源性人底物多肽之间的相互作用基本相同。通常可在基于人细胞的系统中进行本发明所述方法，可选地所述的基于人细胞的系统表达人重组多肽。应当认识到该化合物可结合于LRRK2多肽，或可结合于底物多肽。
在本发明的筛选方法中或其它试验中测试的化合物可为(但不必须为)使用分子模拟技术例如使用计算机技术选择和/或设计(包括修饰)的化合物，其中在所述其它试验中可测量化合物调节LRRK2多肽的蛋白激酶活性的能力。所选择或设计的化合物可以被合成(如果尚未合成)，并测试其对LRRK2多肽的作用，例如其对蛋白激酶活性的作用。所述的化合物可以在本发明所述的筛选方法中进行测试。
所测试的化合物可为已认为可能能够调节蛋白激酶活性的化合物；或可为在可能调节蛋白激酶活性的基础上未被选择的化合物。因此，所测试的化合物可为形成一般的未选择的化合物库的至少一部分的化合物；或可为形成预选化合物库的至少一部分的化合物，例如在认为可能调节蛋白激酶活性的基础上预选的化合物库。
应当认识到特别优选能够高通量操作的筛选试验。
如本领域技术人员所公知的，可能需要评估化合物对其它蛋白激酶具有什么样的作用。例如，为了区别LRRK2和ROCK抑制剂，希望评估化合物对其它蛋白激酶底物磷酸化的作用，例如RockII的底物。例如，就像在例如以上PCT/GB2008/001211的图20和22所示的或如其说明中所讨论的，LRRK2和Rock-II的底物偏好不同。例如，LRRK2不使MYPT磷酸化，而RockII确实使MYPT磷酸化。
ro模型、生物标志物和评估技术的信息可见于例如以下链接，其为本领域技术人员可得的代表性信息，其中/依靠其可适当地进一步测试使用本文所述的筛选方法确定的化合物。
http://www. ninds. nih. gov/about_ninds/plans/nihparkinsons_agenda. htm#Models
http://www. sciencedaily. com/reIeases/2006/07/060729134653. htm (具有线粒体紊乱的小鼠模型)
http://www. sciencedaily. com/re I ease s/2004/10/041005074846. htm(胚胎干细胞模型)
http://en.wikipedia.org/wiki/Parkinson' s_disease
PD动物模型包括6-羟基多巴胺处理的啮齿动物和MPTP处理的灵长类动物。两者均基于对多巴胺能脑细胞(和一些其它类型)的毒性破坏，并通常采用年轻或健康的动物。 由于这些模型复制帕金森氏病的某些主要特征，因此认为其在测试新兴的新疗法中是有用的。
也可对化合物进行其它测试，例如本领域技术人员熟知的毒理学或代谢测试。
本发明所述的筛选方法可包括合成、纯化和/或配制所选择的化合物的步骤。也可配制化合物以用于药学用途，例如用于动物或人的体内试验。
本发明的再一个方面提供了特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser935未磷酸化的LRRK2的抗体。
本发明的再一个方面提供了包括两种或多种以下物质的试剂盒I)特异性结合于 Ser910磷酸化的LRRK2的抗体，或特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体；2)特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser935未磷酸化的LRRK2的抗体；3)14-3-3多肽(可例如以例如洋地黄毒苷对其进行标记)，或特异性结合于14-3-3多肽的抗体；和4)荧光标记的LRRK2多肽，或编码荧光标记的LRRK2的多核苷酸。
本发明的再一个方面提供了以下物质在用于评估试验化合物对基于细胞的系统中的LRRK2的作用的方法中的使用1)特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体；2)特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体；3) 14-3-3多肽，或特异性结合于14_3_3多肽的抗体；和/或4)荧光标记的LRRK2多肽，或编码荧光标记的LRRK2的多核苷酸。
本发明的再一个方面提供了纯化的制备物或部件试剂盒，其包括LRRK2多肽或多核苷酸(即编码LRRK2多肽的多核苷酸)或特异性结合于LRRK2的抗体；和14_3_3多肽或多核苷酸(即编码14-3-3多肽的多核苷酸)或特异性结合于14-3-3多肽的抗体。所述制备物或试剂盒可例如包括重组LRRK2多核苷酸或多肽和重组14-3-3多肽或多核苷酸。如上所讨论的，所述的LRRK2和14-3-3可包括适用于FRET系统的荧光标记。所述制备物或试剂盒可包括经免疫沉淀的LRRK2多肽和14-3-3多肽。所述制备物或试剂盒可包括特异性结合于LRRK2和14-3-3多肽(可例如以例如洋地黄毒苷对其进行标记)的抗体，或特异性结合于14-3-3多肽的抗体。
所述制备物或试剂盒可用于本发明所述的试验。
术语“抗体”包括合成性抗体和保留抗原结合位点的全抗体的片段和变体(例如如上所述的)。抗体可为单克隆抗体，但也可为多克隆抗体制备物、其部分或多个部分(例如Fab 片段或F(ab' )2)或合成性抗体或其部分。Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段都可以在大肠杆菌(E. coli)中表达和分泌，从而允许容易地产生大量所述片段。“ScFv分子”是指Vh和' 伴侣结构域通过可弯曲的寡肽连接的分子。优选IgG类抗体。
可通过已知技术制备针对所选择抗原的合适的单克隆抗体,例如在“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques，，，H. Zola(CRC Press, 1988)和在 “Monoclonal Hybridoma Antibodies: techniques and Applications，，，JGRHurrell (CRC Press, 1982) 中公开的那些，如上所述对其进行修改。可通过细胞融合、通过单价片段的重新连接或通过整个抗体的化学交联来制备双特异性抗体。制备双特异性抗体的方法公开于Corvalen等人，(1987)Cancerlmmunol. Immunother. 24，127-132 和 133-137 和 138-143 中。
涉及保留其特异性结合位点的抗体片段的合成技术的一般性综述见于Winter & Milstein(1991)Nature 349，293-299。
“纯化”是指制备物已至少部分地从其它成分中分离，所述制备物在所述其它成分例如重组细胞的其它成分的存在下形成。实施例中描述了可使用的纯化方法的实例。
所述的制备物可以是基本纯的。“基本纯的”是指所述多肽(或多种多肽)基本不含其它蛋白。因此，我们包括任何组合物，所述组合物包括按所述肽的重量计至少2、3、4、5、 10,15,20或30%的蛋白含量，优选至少50%，更优选至少70%，仍更优选至少90%，最优选至少95%的蛋白含量为所述肽。
因此，本发明也包括含有所述肽和污染物的组合物，其中所述污染物包括按重量计小于96、95、94、90、85、80或70%的组合物，优选小于50%的组合物，更优选小于30%的组合物，仍更优选小于10%的组合物，最优选按重量小于5%的组合物。
本发明也包括与其它成分在体外组合时的基本纯的所述多肽，所述其它成分不是在发现所述多肽的细胞中所发现的所有成分。
本发明的再一个方面包括表征LRRK2突变体的方法，例如在患有帕金森氏病的患者体内发现的LRRK2突变体，所述方法包括步骤a)评估所述的LRRK2突变体的Ser910和 /或Ser935的磷酸化状态；和/或b)评估LRRK2突变体与14_3_3多肽结合的能力。当在所述的LRRK2突变体基于细胞的系统中表达时，所述方法可包括，或进一步包括评估LRRK2 突变体的亚细胞定位的步骤。可使用前文所述的抗体、试剂和基于细胞的系统进行评估步骤。
将本文所涉及的所有文件以引用方式并入本文。为了避免疑义，将Jaleel等人 (2007) Biochem J 405 (2), 307-317,PCT/GB2008/001211 和 PCT/GB2009/002047 以引用方式并入本文。
在本说明书中，之前明显已公布的文件的列表或讨论不应视为承认该文件为现有技术水平的一部分或为公知常识。
现在参照以下非限定性的附图和实施例对本发明进行更加详细的描述。


图I.定量质谱法确定14-3-3是主要LRRK2-相互作用因子。在R6K4SILAC培养基(GFP-LRRK2或GFP-LRRK2 [G2019S])或正常ROKO SILAC培养基(GFP)中培养稳定表达 GFP、野生型全长GFP-LRRK2或全长GFP-LRRK2 [G2019S]突变体的293-HEK细胞以进行多次传代。裂解细胞并将来自GFP和GFP-LRRK2 (A和C)或GFP和GFP-LRRK2 [G2019S] (B和 D)的等量裂解物混合。采用抗-GFP抗体进行免疫沉淀并在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，所述的凝胶以胶体蓝进行染色(A和B)。以箭头(arrowhead)表示LRRK2条带的迁移, 并以箭状物(arrow)表示GFP条带。标志物的分子量标于凝胶的左侧和右侧。切除来自每种凝胶的整个泳道，以胰蛋白酶消化并进行处理以用于质谱。通过轨道阱(Orbitrap)质谱分析各样品，并使用MaxQuant (13. 13. 10版)[28]进行定量，并且结果的总结以表格形式呈现。显示了与进行定量的指定蛋白相对应的肽的数量和序列覆盖百分比，以及在GFP对野生型LRRK2 (C)和GFP对LRRK2[G2019S] (D)的比较中的标记与未标记肽的富集比例。 显示了后验误差概率(posterior errorprobability)PEP,对MaxQuant定量的准确度进行了测定，其中其越接近零，特异性相互作用的概率就越高[28]。
图2. LRRK2与14-3-3相互作用的表征。A.)以对照IgG或抗-LRRK2 (S348C)抗体对5mg的Swiss 3T3裂解物进行免疫沉淀。在4_12%NovexSDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离免疫沉淀物，并以抗LRRK2 (S374C)、Hsp90和pan 14_3_3的抗体进行免疫印迹。B.)以抗pan 14-3-3的抗体对5mg的Swiss 3T3裂解物进行免疫沉淀,在4_12%Novex SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离免疫沉淀物，并以抗pan 14-3-3和LRRK2 (S374C)的抗体进行免疫印迹。C.)以编码GST或GST标记的14-3-3同工型的pEBG质粒转染，并通过在培养基中包括I μ g/ml多西环素诱导其表达LRRK2的T-Rex HEK 293FLAG-LRRK2细胞的裂解物。转染 36小时后，将细胞裂解并以谷胱甘肽-琼脂糖凝胶亲和纯化的蛋白与抗-GST或抗-FLAG 抗体进行免疫印迹。D.)编码LRRK2指定的结构域的片段在HEK-293细胞中瞬时表达，并以抗-FLAG抗体进行免疫沉淀。在4-12%NoVex SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离免疫沉淀物， 并在far western试验中以洋地黄毒苷标记的14_3_3加层的抗-FLAG抗体或14_3_3进行探测。以抗-pan 14-3-3抗体检测共沉淀的14-3-3。E.)以抗-LRRK2 (S348C)将内源性 LRRK2从Swiss 3T3细胞中免疫沉淀，在EDTA存在或不存在下以λ-磷酸酶进行处理，随后以指定抗体进行免疫印迹分析或14-3-3加层试验。F.)如E中所述的，除了以在ΗΕΚ-293 细胞中瞬时转染后所获得的免疫沉淀的FLAG-LRRK2进行实验。
图3. LRRK2磷酸化位点，14-3-3结合位点的确定以及抗_pS910和抗-pS935的表征。A.)以抗-LRRK2100-500 (S348C)将内源性LRRK2从Swiss3T3细胞中免疫沉淀，将 FLAG-LRRK2以抗-FLAG琼脂糖从稳定的可诱导的T-Rex HEK 293细胞中免疫沉淀出来， 并在4-12%NoVex SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并以胶体蓝染色。凝胶代表数个实验。在 LTQ-轨道阱质谱仪上对LRRK2胰蛋白酶肽进行LC-MSMS。B. )LTQ-轨道阱质谱仪所确定的磷酸肽以表格形式显示。显示了观察到的质量(m/z)和预测的质量(M)，以及磷酸化位点和所确定的肽序列。所评价的实验数量(N)显示在列顶端，并显示了确定磷酸化的肽的总次数。C.)放大呈现了 LRRK2的结构域结构，显示了表示结构域边界的氨基酸残基。显示了所确定的磷酸化位点的位置。D.将在A和B中确定的指定的磷酸化位点突变为Ala并在 HEK-293细胞中瞬时表达。以FLAG琼脂糖对LRRK2进行免疫沉淀，将等量的每种蛋白使用 FLAG (总)探测，并将其在加层试验中评估直接结合14-3-3的能力。通过以pan-14_3_3和 Hsp90抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹来测定14-3-3和Hsp90共免疫沉淀(Co-IP)。激酶活性针对30μΜ Nictide进行测定，并使用Odyssey LICOR进行定量免疫印迹，根据免疫沉淀物中的蛋白水平对磷酸酯的掺入进行校正来测定特异性活性，所述的特异性活性以每分钟计数/LICOR吸收单位(cpm/LICOR AU)表示。数据为平均值土SEM，一式两份进行并代表至少4个独立实验。E.)在293细胞中通过瞬时转染表达指定的LRRK2形式。转染后36 小时以Flag抗体对其进行免疫沉淀，并以抗S910 (S357C)和S935 (S814C)的磷酸特异性抗体进行免疫印迹。通过加层试验评估免疫沉淀物与14-3-3的直接结合，并且14-3-3 和Hsp90的共免疫沉淀通过与各自抗体进行免疫印迹来评估。F.)将LRRK2从野生型雄性 C57BL/6小鼠的组织中免疫沉淀，并且针对Ser910和Ser 935磷酸化进行免疫印迹，并通过如E中所述的加层试验评估14-3-3结合。G.)来自智人(NP_940980)、小鼠(NP_080006)、大鼠(XP_235581)、牛(XP_615760)、家犬(XP_543734 )和原鸡(XP_427077 )的 LRRK2 的多序列比对。指示了磷酸化残基丝氨酸910和935的位置。指示了相同的残基。H.)人LRRK2的 Ser910和Ser935磷酸化位点周围的残基的序列比较。I.)来自智人(NP_940980)、黑猩猩 (ΧΡ_001168494 )、小鼠(NP_080006 )、大鼠(XP_235581)、牛(XP_615760 )、家犬(XP_543734 ) 和原鸡(XP_427077)的LRRK2的多序列比对。指示了磷酸化残基丝氨酸910和935的位置。 指示了相同的残基。
图4. H-1152和舒尼替尼处理导致S910和935的去磷酸化和14_3_3相互作用的干扰。A.)以抗-LRRK2 100-500 (S348C)将内源性LRRK2从Swiss3T3细胞中免疫沉淀， 其中以DMSO载体对照或指定浓度的H-1152处理所述细胞90分钟。在4-12%NOVex凝胶上分离免疫沉淀物，并且对其进行14-3-3加层far western分析，并以抗pS910 (S357C)、 抗-pS935 (S814C)和抗-LRRK2 (S374C)抗体进行免疫印迹。通过Odyssey LICOR定量免疫印迹，并以磷酸特异性抗体/总LICOR吸收单位的比例(pS910/LRRK2 [AU])表示LRRK2磷酸化的量。B.)如A中那样对内源性LRRK2免疫沉淀物进行分析，除了在细胞裂解之前将细胞以30 μ M H-1152处理指定的时间。C.)和D.)分别如A.和B.，除了采用舒尼替尼而不是H1152。数据为平均值土SEM，一式两份进行并代表至少2个独立实验。
图5. LRRK2激酶活性控制Ser910和Ser935磷酸化以及14_3_3结合的证据。A 和B)将瞬时表达指定类型的Flag-LRRK2的HEK-293细胞以DMSO载体对照或指定浓度的 Hl 152或舒尼替尼处理90分钟。将细胞在补加了 O. 5%NP40和150mM的裂解缓冲液中裂解， 并进行抗-FLAG免疫沉淀。免疫沉淀物在4-12%NoVex SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并以 FLAG (总LRRK2)、抗-pS910和抗-pS935进行免疫印迹，并进行14_3_3加层试验。在2个分别的实验中获得了相似的结果。
图6. Ser910和Ser935磷酸化不由LRRK2自身磷酸化介导的证据。将内源性LRRK2 从Swiss 3T3细胞中免疫沉淀，其中所述的细胞是以DMSO或30 μ M Η1152或10 μ M舒尼替尼处理2h以诱导Ser 910和Ser 935的磷酸化的。将免疫沉淀物以含有O. 5M NaCl的裂解缓冲液洗涤以除去抑制剂，然后在镁-ATP存在或不存在下，在含有20 μ M Nictide的激酶缓冲液中温育30min。温育后，将免疫沉淀物在8000rpm下离心O. 5min,并且将上清液点样于P81纸上以测定LRRK2的激酶活性。将样品缓冲液加入球状珠中，并且在免疫印迹分析后对LRRK2 S910和S935磷酸化进行定量。也对膜进行放射自显影以评估LRRK2自身磷酸化。H-1152对LRRK2激酶试验的较小作用是不显著的。
图7. LRRK2如何控制导致14_3_3结合的S0er910和Ser935磷酸化的建议模型。 我们的数据表明LRRK2激酶活性刺激作用于Ser910和Ser935的蛋白激酶的活性或抑制作用于Ser910和Ser935的蛋白磷酸酶的活性。这使得LRRK2能够与14_3_3同工型相互作用并稳定弥散的LRRK2的胞质定位。以LRRK2抑制剂处理细胞，从而导致Ser910和Ser935 的去磷酸化和14-3-3同工型的解离。我们的研究表明可采用Ser910和Ser935的LRRK2 磷酸化以及14-3-3结合作为所开发的LRRK2抑制剂的基准疗效的生物标志物。
图8. 14-3-3结合影响LRRK2的细胞质定位。A.)将包含指定LRRK2形式的稳定可诱导的T-REx细胞系以O. I μ g/ml多西环素诱导24小时，以诱导GFP-LRRK2的表达。将来自所诱导的每种突变体细胞的等量细胞裂解物以抗-GFP抗体进行免疫印迹分析以检测融合蛋白，或以抗-GAPDH作为载样对照。B.)显示了代表指定形式的GFP-LRRK2的培养物的荧光显微照片。以白色箭头表示在非14-3-3结合突变体中所观察到的GFP-LRRK2胞质池。
图9. 41种与帕金森氏病相关的LRRK2突变体的活性和14_3_3结合。插图描述了 LRRK2的结构域结构，标出了富亮氨酸重复序列(LRR)、复合GTP酶结构域的Ras(R0C)、Roc 的羧基末端(COR)、激酶催化结构域(激酶)和最小WD40重复结构域(WD40)。显示了 H)相关突变的位置。标明了所述的结构域的氨基酸边界。将全长FLAG标记的LRRK2的指定的变体在HEK 293细胞中瞬时表达，并进行免疫沉淀分析。免疫沉淀物的激酶活性针对LRRKtide 进行评估，并使用LICOR技术通过LRRK2的定量抗FLAG免疫印迹分析测定特异性活性，并且所述的特异性活性定义为cpm/LICOR。将野生型LRRK2活性设置为1，突变活性是相对于野生型的。针对三个实验一式两份进行试验，条形图为s.e.m。FLAG-LRRK2免疫沉淀物也以抗-FLAG、抗-pSer910和抗-pSer935抗体进行免疫印迹分析。通过14-3-3 farwestern 分析法和用于共沉淀14-3-3的14-3-3免疫印迹法评估14_3_3结合到LRRK2变体。
图10.在LRRK2[R1441C]敲入的小鼠中的Ser910/Ser935磷酸化和14-3-3结合的破坏。快速将三只纯合LRRK2[R1441C]敲入的小鼠和三只野生型同窝幼仔对照的脑、肾脏和脾脏组织切除并在液氮中迅速冷冻。将LRRK2从脑、肾脏或脾脏的整个组织中免疫沉淀。 针对LRRK2在Ser910和Ser935的磷酸化和总LRRK2对免疫沉淀物进行免疫印迹。通过 14-3-3 farwestern分析来评估与14_3_3结合相互作用的能力。注意到可用于测量Ser910 磷酸化的脾脏的样品不足。
图11. 41种H)相关的LRRK2突变体的定位。将包含指定突变的稳定可诱导的 T-REx细胞系的平行培养物以I μ g/ml多西环素诱导24小时，以诱导GFP-LRRK2的表达。 A.)将各个突变体所诱导细胞的等量细胞裂解物以抗-GFP抗体进行免疫印迹分析，以检测融合蛋白，或以抗-ERKl作为载样对照。B.)显示了代表每种H)相关突变体的培养物的荧光显微照片(画面1-43)。以白色箭头表示GFP-LRRK2胞质池。在两个独立生成的稳定细胞系中一式两份地进行定位分析。所显示的每个显微照片的更大的画面如图12所示。
图12. 41种H)相关的LRRK2突变的作用的总结。
激酶活性与野生型有关，其中-表示无可检测的活性，+等于大约无变化，每增加一倍就用一个额外的+表示。在磷酸丝氨酸910和935磷酸化和直接14-3-3结合的影响中，其中无变化表示为++，+表示Ser910/Ser935磷酸化或14_3_3结合降低表示无可检测的Ser910/Ser935磷酸化或14-3-3结合。对于弥散的胞质染色，定位表示为弥散的。聚集的表示胞质池的外观。我们将LRRK2突变体分为六组。第I组突变体显示激酶活性升高 >2-倍，但14-3-3结合和弥散定位正常(绿色阴影_*)。第2组突变体显示激酶活性正常但 Ser910/Ser935磷酸化以及14_3_3结合降低，并在胞质池内蓄积(桃红色阴影_**)。第3组突变体显示激酶活性正常但Ser910/Ser935磷酸化以及14_3_3结合降低，并显示弥散的胞质定位(蓝色阴影_#*)。第4组突变体显示激酶活性、Ser910/Ser935磷酸化以及14_3_3 结合正常，但在胞质池中蓄积(黄色阴影_****)。第5组突变体显示无激酶活性、Ser910/ Ser935磷酸化或14-3-3结合，并且弥散性定位(红色阴影_*****)。第6组突变体显示与野生型LRRK2相似的性质(无阴影)。
图13.41种H)相关LRRK2突变体的定位。与图11所示的定位数据相同，不同的是呈现了每张显微照片的较大画面以提高清晰度。
图14. 14-3-3结合的破坏诱导LRRK2在胞质聚集体中的蓄积。A.)将稳定的可诱导的包含指定形式的LRRK2的T-REx细胞系以O. I μ g/ml多西环素诱导24小时，以诱导 GFP-LRRK2的表达。在指定剂量的H-1152存在或不存在下，在固定之前处理指定细胞系 90min。显示了 GFP-LRRK2定位的代表性荧光显微照片。以白色箭头指示GFP-LRRK2的胞质聚集体。B.)显示了代表指定类型的GFP-LRRK2培养物的荧光显微照片。以白色箭头指示GFP-LRRK2的胞质聚集体。一式两份地进行定位分析，在两个独立实验中观察到相似的结果。
图15.将内源性 LRRK2 以抗-LRRK2100-500 (S348C)从 Swiss 3T3 细胞中免疫沉淀出来，其中所述的Swiss 3T3细胞以DMSO载体对照或指定浓度的ROCK强效抑制剂 GSK429286A处理90分钟。将免疫沉淀物以指定抗体进行免疫印迹分析以及进行14_3_3加层far western分析。通过OdysseyLICOR分析对免疫印迹分析进行定量,并且LRRK2磷酸化的量显示为磷酸特异性抗体/总LICOR吸收单位的比值(pS910/LRRK2[AU])。
图16.将稳定地表达GFP-LRRK2的HEK-293使用DMS0，或者使用指定浓度下的以下溶于DMSO的抑制剂处理90分钟。舒尼替尼(LRRK2抑制剂[40])、⑶C-0941 (PI3K抑制剂[41])、PI-103 (双重 mT0R/PI3K 抑制剂[42] )、BX-795 (双重 MARK/PDK1 抑制剂[43]、 AKTi 1/2 (PKB 抑制剂[44] )、KU0063794 (mTOR 抑制剂[45] )、CHIR-99021 (GSK3 抑制剂[46])、BAY439006 (Raf 抑制剂[47] )、PD_0325901 (MEKI 抑制剂[48] )、BID_1870 (RSK 抑制剂[49] )、BIRB-0796 (p38MAPK 抑制剂[50] )、SB203580 (p38MAPK 抑制剂[51] )、AS601245 (JNK 抑制剂[52])、SP600125 (JNK 抑制剂[53] )、BMS345541 (IKK 抑制剂[54] ),PS-1145 (IKK抑制剂[55])、TPL2抑制剂31 (Cot/TPL2抑制剂[56])、坏死稳定素(RIPK抑制剂[57])、H-89(双重 PKA/R0CK 抑制剂[58] )、R0-31_8220(PKC 抑制剂[59])、粗糠柴毒素(PKC 抑制剂[60])、ST0-609 (CaMKK 抑制剂[61])、化合物 C (AMPK 抑制剂[62] )、AG490 (JAK 抑制剂[63])、PP1 (Src 抑制剂[64])、PP2 (Src 抑制剂[65] )、GSK429286A (ROCK 抑制剂[40])、哈尔明碱(双重 CDK/DYRK 抑制剂[66])、Roscovitine (CDK 抑制剂[67])、SU-6668 (双重Src/Aurora激酶抑制剂[68] )、VX_680(Aurora激酶抑制剂[69])、栎草亭(PMK抑制剂[70])、40IKuDOS (DNAPK 抑制剂[71] )、BI_2536 (PLK1 抑制剂[72])。裂解后，将 30 μ g 裂解物通过SDS-PAGE分离，并进行免疫印迹分析以得到Ser910和Ser935上的LRRK2磷酸化。通过GFP免疫印迹评估总LRRK2。所显示的免疫印迹代表2个独立的实验。
实施例I :激酶活性的抑制导致LRRK2在Ser910/Ser935上的去磷酸化和14_3_3 结合的破坏。用于评估LRRK2抑制剂的基于细胞的试验的开发
富亮氨酸重复序列蛋白激酶-2 (LRRK2)在大量帕金森氏病患者中发生突变。由于Gly2019变为Ser的常见突变提高激酶催化活性，因此小分子LRRK2抑制剂在治疗帕金森氏病中可以是有用的。然而， 由于尚未确定可用于开发稳定的基于细胞的试验LRRK2的生理学底物或下游效应子，因此难以评估抑制剂的有效性。我们在这里证明了内源性LRRK2 与内源性14-3-3同工型相互作用。该相互作用由位于富亮氨酸重复结构域之前的保守 Ser910和Ser935残基的磷酸化介导。令人惊讶的是，以两种结构不相关的LRRK2抑制剂 (H-1152或舒尼替尼)处理Swiss 3T3细胞可诱导内源性LRRK2在Ser910和Ser935上去磷酸化，从而破坏14-3-3相互作用。我们认为H-1152和舒尼替尼通过抑制LRRK2激酶活性来诱导Ser910和Ser935的去磷酸化；这些化合物不能诱导耐药性LRRK2 [A2016T]突变体的显著去磷酸化。此外，与LRRK2的非14-3-3结合突变体在不连续的胞质池中蓄积，而不是弥散性地定位于整个细胞质中的研究结果相一致的是,H-1152导致LRRK2在胞质池中蓄积。这些数据表明Ser910、Ser935的去磷酸化或14_3_3结合的破坏和/或监视LRRK2 胞质定位可用作评估体内LRRK2激酶抑制剂的相对有效性的标志物。这些研究结果将有助于LRRK2激酶抑制剂的开发。其也促进进一步研究，以了解如何通过LRRK2控制Ser910和 Ser935的磷酸化，并且建立与帕金森氏病发展的任何关系。
材料和方法
试剂和一般方法。组织培养试剂来自Life Technologies。谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B 来自 Amersham Biosciences, [ Y-32P]-ATP 来自 Perkin Elmer。P81 憐酸纤维素纸来自 Whatman。Pepceuticals 合成了 Nictide。Flp-in T-Rex 系统来自 Invitrogen,并且如前所述地，稳定的细胞系是根据制造商的指示通过潮霉素选择来产生的[8]。使用标准规程进行限制性内切酶消化、DNA连接和其它重组DNA程序。使用Quick-Chang点突变试剂盒(Stratagene)进行所有突变。根据制造商的规程，使用Qiagen或Invitrogen质粒Maxi试剂盒由大肠杆菌DH5 α纯化得到用于转染的DNA构建体。所有DNA构建体通过DNA测序确证,该测序由英国苏格兰邓迪大学生命科学院的测序服务(TheSequencing Service,School of Life Sciences, University of Dundee, Scotland, U. K.) 使用 DYEnamic ET 终止子化学(Amersham Biosciences)在 AppliedBiosystems 的自动化 DNA 测序仪上进行。H1152购自Calbiochem,并且舒尼替尼购自LC实验室。
缓冲液。裂解缓冲液含有50mM Tris/HCl, pH 7.5、ImM EGTA、ImMEDTA、l%(w/ v) ImM原钒酸钠、IOmM β-甘油磷酸钠、50mM NaF、5mM焦磷酸钠、O. 27M蔗糖、ImM苯甲脒和 2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，并且按照指示补加l%(v/v) Triton X-100或含有150mM NaCl的 O. 5%(v/v)NP-40。缓冲液A含有50mM Tris/HCl,pH 7. 5、50mM NaCl、0. ImM EGTA和0. l%(v/ v) 2-巯基乙醇和0. 27M蔗糖。λ -磷酸酶反应在补加了 ImM MNCl2和2mM DTT的缓冲液A 中进行。
细胞培养、处理和细胞裂解。在补加了 10%FBS、2mM谷氨酰胺和IX抗真菌素/抗生素溶液的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养HEK-293和Swiss 3T3细胞。在补加了 10%FBS和2mM谷氨酰胺、IX抗真菌素/抗生素[青霉素/链霉素]、15 μ g/ml灭瘟素和100 μ g/ml潮霉素的DMEM中培养T-REx细胞系。通过在培养基中包含I μ g/ml多西环素指定时间或24小时来诱导培养物表达指定蛋白。
通过聚乙烯亚胺法进行细胞转染[12]。如果使用抑制剂，将其溶于DMSO中并以指定浓度使用，并将等体积的DMSO用作对照。培养基中DMSO的终浓度从来不高于O. 1% (v/ V)。在裂解前将抑制剂加入培养基中保持指定的时间。对于每个15cm培养皿，以I. Oml补加了指定去垢剂的裂解缓冲液裂解HEK 293细胞，以O. 6ml所述裂解缓冲液裂解3T3细胞， 并通过在4° C下通过16，OOOx g离心10分钟进行澄清。诱导和抑制处理后，以PBS洗涤后，在室温下以SDS裂解缓冲液裂解表达T-REx-GFP的细胞。将SDS裂解物煮沸并超声处理以降低其粘度。当不立即使用时，将所有裂解物上清液在液氮中速冻并储存于-80° C下直到使用。使用Bradford法测定蛋白浓度，以BSA作为标准品。
抗体。抗-LRRK2100-500 (S348C 和 S406C)和抗-LRRK2 2498-2514 (S374C)如前所述[8]。通过将KLH结合的磷酸肽VKKKSNpSISVGEFY(其中pS为磷酸丝氨酸)注入绵羊体内，生成抗LRRK2磷酸丝氨酸910 (S357C)的抗体，并通过分别抗磷酸和去磷酸肽的正性和负性选择进行亲和纯化。通过将KLH结合的磷酸肽NLQRHSNpSLGPIFDH(其中pS为磷酸丝氨酸)注入绵羊体内，生成抗LRRK2磷酸丝氨酸935 (S814C)的抗体，并通过分别抗磷酸和去磷酸肽的正性和负性选择进行亲和纯化。绵羊多克隆抗体S662B是针对MBP-MYPT鸡氨基酸(714-1004)产生的。抗MYPT磷酸苏氨酸850的兔多克隆抗体来自Upstate (#36-003)。 抗GFP抗体(S268B)是针对重组GFP蛋白产生的，并且针对该抗原亲和纯化。抗-FLAG M2 抗体和亲和基体来自Sigma (A2220)。Nanotrap GFP粘合剂亲和基体来自ChromoTek。识别14-3-3的兔多克隆抗体(K-19，SC-629)和对照兔IgG (SC-2027)抗体来自SantaCruz biotechnology ο HSP90 抗体来自 Cell signal Iingtechnology (#4877)。抗-MARK3 来自 Upstate (#05-680)ο
免疫程序。将细胞裂解物(10-30 μ g)通过在SDS聚丙烯酰胺凝胶或Novex 4-12% 梯度凝胶上进行电泳来分离，并电转染至硝酸纤维素膜上。将膜使用50mM Tris/HCl, pH 7. 5,0. 15M NaCl和O. 1% (v/v)吐温(TBST缓冲液)中的5%脱脂牛奶(w/v)进行封闭。对于磷酸_抗体，一抗在I μ g/ml的浓度下一抗，稀释在5%脱脂牛奶的TBST溶液中，并包含 10 μ g/ml去磷酸化肽进行使用。所有其它抗体在I μ g/ml下，在5% (w/v)牛奶的TBST溶液中使用。使用荧光团结合的二抗(Molecular Probes)进行免疫复合物的检测，接着使用 Odyssey LICOR或通过辣根过氧化物酶结合的二抗(Pierce)和增强的化学发光试剂进行显影。对于免疫沉淀，按照I μ g抗体/ μ I珠的比例将抗体非共价地偶联于蛋白G-琼脂糖凝胶，或利用抗-FLAG M2-琼脂糖。将细胞裂解物与偶联的抗体温育I小时。将免疫复合物以补加了 0. 3M NaCl的裂解缓冲液洗涤两次，以缓冲液A洗涤两次。将沉淀物用作激酶来源或立即通过免疫印迹进行分析。用于加层far western分析的洋地黄毒苷(DIG)标记的 14-3-3如[13]所述地进行制备。为了直接评估14-3-3与LRRK2的相互作用，将免疫沉淀物电转染至硝酸纤维素膜上，并以5%脱脂牛奶封闭30分钟。以TBST洗涤后，将膜在4° C 下与DIG标记的14-3-3温育过夜，其中所述DIG标记的14_3_3是在5%BSA的TBST溶液中稀释至I μ g/ml的。以HRP标记的抗-DIG Fab片段(Roche)检测DIG 14—3—3。
SILAC培养基。以10%经透析的FBS (Hyclone)制备SILAC DMEM (高葡萄糖，无 NaHCO3, L-谷氨酰胺,精氨酸,赖氨酸和甲硫氨酸Biosera#A0347)并补加甲硫氨酸、谷氨酰胺、NaHCO3、标记或未标记的精氨酸和赖氨酸。用以下同位素标记以1:10的比例在SILAC DMEM中培养含有GFP标记的蛋白的细胞，传代三次。对于GFP对野生型LRRK2，将L-精氨酸(84 μ g/ml ；Sigma-Aldrich)和 L-赖氨酸(146 μ g/ml 赖氨酸；Sigma-Aldrich)加入 GFP “轻”培养基中，而将 L-精氛酸 13C 和 L-赖氛酸 13C (Cambridge IsotopeLaboratory) 以相同浓度加入GFP-LRRK2野生型“重”培养基中。对于GFP对LRRK2G2019S实验，将 L-精氨酸和L-赖氨酸加入GFP “轻”培养基中，将L-精氨酸13C/15N和L-赖氨酸13C/15N (Cambridge Isotope Laboratory)加入 GFP-LRRK2G2019S “重”培养基中。氛基酸浓度基于正常DMEM (Invitrogen)的配方。制备后将SILAC培养基混合均匀，并通过O. 22-μ m滤器(Millipore)过滤。通过在培养基中包括多西环素，来诱导代谢标记的细胞24小时以表达GFP或GFP-LRRK2融合蛋白。
SILAC质谱分析法。对于每个IOcm培养皿，用O. 5ml的补加了 l%Triton X-100 的裂解缓冲液裂解经代谢标记并被诱导表达GFP或LRRK2-野生型或G2019S的细胞。对于各个条件，分别地将9mg细胞裂解物在4° C下以床体积为20 μ I的GFP粘合剂琼脂糖珠单独地进行免疫沉淀I小时。用5ml补加了 l%Triton-X 100和300mM NaCl的裂解缓冲液洗涤珠子一次，然后以IOml该裂解缓冲液洗涤一次。随后将珠用5ml储备缓冲液洗涤一次，然后以IOml所述储备缓冲液洗涤一次。在70° C下以IX LDS样品缓冲液洗脱结合蛋白的珠lOmin，然后通过O. 22 μ m spin-X柱。将对照GFP洗脱物与等量的野生型LRRK2或 LRRK2G2019S的洗脱物合并，并且如上所述进行还原和烷基化。在12%NoVex凝胶上分离样品，仅占用一半凝胶。以胶体蓝对凝胶染色过夜并脱色3小时。将整个泳道共切割为9个条带，并如上所述地以胰蛋白酶进行消化[30]。
妝的质谱分析。在Biosphere C18 捕获柱(O. Imm id x 2mm, Nanoseparations， Holland)上分离消化物，所述捕获柱与安装在具有溶剂A (2%乙腈/O. 1%甲酸/98%水)和溶剂 B (90% 乙臆 /10% 水 /O. 09% 甲酸)的 Proxeon Easy-LC 纳米流 LC-系统(Proxeon, Denmark)上的 PepMap C18 纳米柱(75μηι x 15cm, Dionex Corporation)相连。以 7 μ I/ min的恒定流速将10 μ I样品(共2 μ g蛋白)装载于溶剂A中的捕获柱上，并在相同流速下洗涤3min。捕获富集后，将肽以5-50%线性梯度的溶剂B在300nl/min的恒定流速下洗脱90min。该HPLC系统通过安装有5cm Picotip FS360-20-10发射器的纳米电喷雾离子源(Proxeon Biosystems)偶联于线性离子讲轨道讲混合质谱仪(LTQ-轨道讲XL, Thermo Fisher Scientific Inc)。将喷雾电压设置为I. 2kV，将被加热的毛细管的温度设置为200° C。累积500，000离子后，在轨道阱中获得剖面模式下的全扫描MS测量谱(m/z 350-1800)，分辨率为60，000。10, 000离子累积后，在LTQ中来自预览扫描的轨道阱中的五种最强的肽离子通过碰撞诱导的解离分裂成碎片(归一化的碰撞能量35%，活化QO. 250， 活化时间30ms)。全扫描的最大填充时间为1，000ms，MS/MS扫描的为150ms。能够进行先驱离子电荷态筛选，并排除所有未分配的电荷态以及单电荷物种。锁定质量选项能够使全谱扫描提高质量准确度。使用Xcalibur软件获得数据。
质谱数据的MaxQuant 分析。使用 MaxQuant (I. 0. 13. 13 版)(http://www. maxquant. org)和Mascot搜索引擎(Matrix Science, 2. 2. 2版)软件将每个试验所获得的原始质谱数据文件整理成单一的定量化数据集。将酶特异性设置为胰蛋白酶的特异性，使得能在脯氨酸残基的N-端和天冬氨酸和脯氨酸残基之间进行切割。软件中使用的其它参数可变修饰_甲硫氨酸氧化；数据库_目标-诱导人MaxQuant(ipi. HUMAN. v3. 52.诱导) (含有148，380个数据库条目)；标记-R6K4 [对于GFP对野生型LRRK2]或R10K8 [对于GFP 对LRRK2G2019S] ;MS/MS耐受性-O. 5Da ; (e)每100Da_5的顶端MS/MS峰；最大遗漏切割_2 ； 最大标记的氨基酸3 ;错误发现率(FDR) :1%。
LRRK2免疫沉淀激酶试验。在30 μ M Nictide肽底物存在下，将免疫沉淀的 LRRK2 作为激酶来源在总体积为 50μ I 的 50mM Tris pH 7. 5,0. ImMEGTA, IOmM MgCl2 和 O. ImM[ y -32PlATP r500-1000cpm/pmol)中进行肽激酶试验。通过将30 μ I反应混合物涂在Ρ81磷酸纤维素纸上并浸入50mM磷酸中来终止反应。充分洗漆后,通过契伦科夫计数法对反应产物进行定量。将剩余反应的其中一半使用Odyssey LICOR系统进行免疫印迹分析， 并且特异性的活性表示为cpm/LICOR独立密度值。
将500 μ g转染的细胞裂解物使用床体积为5 μ I的抗-FLAG琼脂糖免疫沉淀Ihr。 用补加了 300mM NaCl的裂解缓冲液洗涤珠子两次，然后用缓冲液A洗涤两次。肽激酶试验在 200 μ M LRRKtide 肽底物长变体(RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR) [9，10]或 Nictide 肽底物(RLGffffRFYTLRRARQGNTKQR) [10]存在下，在含有免疫沉淀的LRRK2的总体积为50 μ I的 50mM Tris pH 7. 5,0. ImM EGTA, IOmM MgCl2 和 O. ImM[ λ -32P]ATP r300-500cpm/pmol)中进行。通过将30 μ I反应混合物涂在Ρ81磷酸纤维素纸上，并浸入50mM磷酸中终止反应。 充分洗涤后，通过契伦科夫计数法对反应产物进行定量。将剩余反应的一半使用Odyssey LICOR系统进行免疫印迹分析，特异性活性表示为cpm/LICOR独立密度值。
通过质谱分析法确定磷酸化位点。分别使用抗-LRRK2 (100-500)或抗-FLAG琼脂糖将内源性和重组LRRK2从50mg的Swiss 3T3裂解物或被诱导表达FLAG-LRRK2细胞裂解物的T-Rex细胞中免疫沉淀。使用2X LDS样品缓冲液或200 μ g/ml FLAG肽将免疫沉淀物从亲和基体上洗脱下来，然后通过O. 2 μ m Spin-X柱(Corning)过滤,之后以IOmM二硫苏糖醇进行还原，并以50mM碘乙酰胺进行烧基化。70° C下加热样品IOmin并在4-12%Novex 凝胶上分离，之后以胶体蓝(Invitrogen)染色。切割与LRRK2对应的条带，并如前所述地以胰蛋白酶进行消化[30]。如上所述地在LTQ轨道阱XL质谱仪(Thermo)上分析样品，除了在线性离子阱中使用磷酸从母体离子上中性丢失的多级活化使前5个离子分裂成碎片(对于 z=2, 3和4,中性丢失质量=49, 32. 33和24. 5)。使用raw2msm (由M. Mann赠送)从原始文件创建Mascot通用文件,并使用针对内源性LRRK2的International ProteinIndex(IPI) 小鼠数据库或针对重组LRRK2的IPI人类数据库在本地Mascot服务器(matrixscience. com)上对所述Mascot通用文件进行搜索。
荧光显微法。HEK-293Flp_in T-REx购自Invitrogen，使用标准规程生成包含GFP标记的野生型和LRRK2的突变形式的稳定细胞。将细胞铺板于在4-孔玻璃底的CC2涂覆的腔室玻片(Nunc)中。在铺板一天后以0. I μ g/ml多西环素诱导细胞，24hr 后将细胞在磷酸缓冲盐水缓冲的4%多聚甲醛(购自USB, #19943)中固定。将细胞在 ProLong Gold (Invitrogen)中装配(mounted)并在相同的针对每个突变体的设置下,使用 a Plan-ApochromatxlOO物镜在Zeiss LSM 700共聚焦显微镜上成像。
结果
LRRK2与14_3_3结合。我们采用定量的基于细胞培养中氨基酸稳定同位素标记 (SILAC)的质谱来确定蛋白质，所述的蛋白质与稳定表达的全长GFP-LRRK2 (图IA和1B)以及来自HEK-293细胞的GFP-LRRK2[G2019S]突变体(图IC和1D)的免疫沉淀物相关。与仅有GFP相比，富集到10至30倍更高水平的GFP-LRRK2或GFP-LRRK2 [G2019S]的顶端命中包括野生型LRRK2的14-3-3的β、η、θ、ζ或ε同工型(图IB)和针对LRRK2 [G2019S] 的β、θ、ζ、Y或ε同工型(图ID)。观察到的两个其它主要相互作用因子包括与其激酶特异性靶向⑶C37亚单位相关的热休克蛋白-90 (Hsp90)分子伴侣的两种同工型(富集5 至15倍)。Hsp90和⑶C37与野生型LRRK2以及LRRK2 [G2019S]突变体均相关，并且之前已报导其与LRRK2相互作用[14]。在我们的相互作用因子筛选中未观察到其它显著的LRRK2 的相互作用因子。
我们发现内源性14-3-3以及Hsp90与内源性LRRK2从Swiss 3T3细胞中免疫共沉淀(图2A)。我们也观察到内源性LRRK2与识别内源性14-3-3同工型的抗体从Swiss 3T3 细胞中免疫共沉淀(图2B)。将编码所有七种人14-3-3同工型的表达的质粒转染至先前生成的稳定表达全长FLAG-LRRK2的HEK-293细胞中[8]。亲和纯化后，除了非典型的σ同工型，14-3-3的所有其它类型均与FLAG-LRRK2相互作用(图1C)。我们也观察到虽然在293 细胞中全长LRRK2与内源性14-3-3连接，但在平行实验中，所测试的各种分离的LRRK2的结构域不能与14-3-3结合(图1D)。采用14-3-3加层farwestern结合试验证实了该观察数据，其中全长LRRK2，而不是分离的结构域与洋地黄毒苷标记的14-3-3结合(图ID-下方画面)。
14-3-3同工型主要与其结合伴侣上的特异性磷酸化残基相互作用[11，15]。为了证实14-3-3与LRRK2的连接是否依赖于磷酸化，我们在λ -磷酸酶的存在或不存在下温育内源性LRRK2 (图2Ε)或过表达的FLAG-LRRK2 (图2F)。以λ -磷酸酶处理内源性或过表达的LRRK2显著降低使用加层试验评估的14-3-3的相互作用。在试验中包含EDTA可抑制入-磷酸酶，并防止λ _磷酸酶抑制14-3-3与LRRK2结合(图2Ε和2F)。λ -磷酸酶处理后 14-3-3与LRRk2的残余结合可能是由于LRRK2的不完全去磷酸化。
内源性LRRK2上主要磷酸化位点的作图。为了确定哪一个(哪些)磷酸化残基介导与14-3-3的结合，我们对从小鼠Swiss 3T3细胞中免疫沉淀的内源性LRRK2进行了详细的磷酸肽轨道阱质谱分析(图3A)。这显示了三个清晰的磷酸化位点，分别是Ser860、Ser910 和Ser935 (图3B)。这些残基位于LRRK2的N端非催化区域，恰好在富亮氨酸重复序列之前(图3C)。我们也分析了在HEK-293细胞中过表达的全长人FLAG-LRRK2的磷酸化，这证实了 Ser860、Ser910和Ser935为主要磷酸化位点(图3A和3B)。此外，我们发现在过表达的人FLAG-LRRK2样品中有三种其它磷酸化位点，分别是Ser955、Ser973和Ser976 (图3B和 3C)。在我们对内源性LRRK2的分析中也检测到包括Ser955、Ser973和Ser976的磷酸肽， 但是由于这些肽的丰度较低，我们不能确定准确的磷酸化位点(数据未显示)。
Ser910和Ser935的磷酸化介导14_3_3结合，但不控制激酶活性。我们观察到 Ser860、Ser955、Ser973、Ser976 或 Ser973+976 磷酸化位点突变为 Ala 不影响 14-3-3 与全长FLAG-LRRK2的结合(图3D)。然而令人惊讶的是，Ser910和/或Ser935突变为Ala 消除相互作用，这表明这些残基的磷酸化介导LRRK2与14-3-3同工型的结合(图3D)。针对Nictide底物肽进行测量，所确定的磷酸化位点的突变不影响LRRK2的蛋白激酶活性(图3D)
我们接下来生成了识别在Ser910或Ser935磷酸化的LRRK2的磷酸特异性抗体。 由于Ser910突变为Ala消除了磷酸_Ser910抗体对LRRK2的识别，并且相似地，Ser935的突变消除了磷酸_Ser935抗体的识别，因此这些抗体具有特异性(图3E)。通过LICOR进行定量，我们始终观察到Ser910突变为Ala使Ser935的磷酸化降低约两倍，并且同样的是 Ser935的突变能使Ser910的磷酸化降低约两倍(图3E)。利用这些抗体，我们证明从小鼠脑、肾脏和脾脏中免疫沉淀的内源性LRRK2在Ser910以及Ser935发生磷酸化，并与14_3_3 结合(图3F)。
序列比对显不哺乳动物物种中的Ser910和Ser935位点及其周围的残基是闻度保守的(图3G)。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)或黑腹果蚬(Drosophila melanogaster)的LRK-1中，或事实上哺乳动物的LRRKl中不存在包括Ser910和Ser935的该区域。Ser910和Ser935周围的残基的比较表明某些惊人的相似性(图3H即-3和-4位的碱性残基，-2位的Ser残基，-I位的Asn和+1位的较大疏水性残基)。
LRRK2抑制剂诱导Ser910/935的去磷酸化并破坏14_3_3结合。以递增量的 LRRK2抑制剂H-1152 (图4A)或舒尼替尼(图4C)温育Swiss 3T3细胞导致内源性LRRK2 在Ser910和Ser935发生剂量依赖性的去磷酸化，并且该去磷酸化伴随14_3_3结合的伴随性降低。10-30 μ M !1-1152或3-1(^] 舒尼替尼几乎诱导36^10和36^35的完全去磷酸化，导致14-3-3结合的缺失。在30min内观察到Η-1152 (图4B)和舒尼替尼(图4D)对内源性LRRK2-Ser910/Ser935磷酸化和14_3_3结合的抑制作用，并且持续至少2小时。
LRRK2激酶活性控制Ser910和Ser935磷酸化以及14-3-3结合的证据。为了确定Hl 152和舒尼替尼对LRRK2磷酸化和14_3_3结合的作用是否由LRRK2蛋白激酶活性的抑制引起，我们以LRRK2抑制剂处理HEK-293过表达LRRK2 [G2019S]或Hl 152/舒尼替尼耐药性LRRK2[A2016T+G2019S]突变体。当使用内源性LRRK2观察时，我们发现H-1152和舒尼替尼诱导帕金森氏病LRRK2[G2019S]突变体在Ser910和Ser935发生剂量依赖性去磷酸化，以及破坏与14-3-3的结合(图5A-上部画面)。然而重要的是，H-1152或舒尼替尼均未显著抑制Ser910或Ser935磷酸化或14_3_3与耐药性LRRK2 [A2016T+G2019S]突变体的结合(图5A-下部画面)。这强有力地表明H1152和舒尼替尼诱导Ser910以及Ser935的去磷酸化并从而破坏14-3-3结合的能力取决于这些化合物抑制LRRK2蛋白激酶活性的能力。
与证明H-1152和舒尼替尼对突变体LRRK2[G2019S]的抑制比对野生型LRRK2的抑制强2至4倍的药理学数据一致的是[8]，我们发现H1152和舒尼替尼在诱导去磷酸化和破坏与14-3-3的结合时，其对LRRK2[G2019S]的诱导和破坏比对野生型LRRK2更强(比较图5A和图5B-上部画面)。H-1152和舒尼替尼在293细胞中诱导野生型FLAG-LRRK2去磷酸化的能力与观察到的这些药物对Swiss 3T3细胞中内源性LRRK2的作用相似(比较图 4 和 5B)。
LRRK2不使Ser910和Ser935自身磷酸化的证据。与丝氨酸残基相比，LRRK2明显倾向于磷酸化苏氨酸[8],表明Ser910和Ser935磷酸化可能不由自身磷酸化介导。与此一致的是，研究LRRK2自身磷酸化位点的其它研究已对许多磷酸苏氨酸自身磷酸化位点进行了作图，但未报导LRRK2在Ser910或Ser935磷酸化[16-18]。为了进一步研究内源性 LRRK2是否能够在Ser910和Ser935对其自身进行磷酸化，我们不以药物或以30μΜΗ_1152处理Swiss 3T3细胞以诱导Ser910和Ser935的去磷酸化(图6)。对内源性LRRK2进行免疫沉淀并洗涤除去药物，在镁-ATP存在或不存在下温育免疫沉淀物。30min后，对LRRK2激酶活性以及Ser910和Ser935的磷酸化进行定量。这些研究显示从H-115处理的细胞中分离的LRRK2发生去磷酸化，并且其与从未处理的细胞中分离的LRRK2具有相同的活性，表明药物已除去(图6)。重要的是，我们观察到在以镁-ATP温育来自H1152处理的细胞的LRRK2 后，Ser910或Ser935的磷酸化未升高。在此自身磷酸化反应中，从未经药物处理的细胞中分离的LRRK2在Ser910和Ser935上磷酸化的量也未增加。
多信号转导抑制剂对Ser910/Ser935磷酸化的作用。为了深入了解Ser910和Ser 935去磷酸化的特异性，以一组33种激酶抑制剂处理稳定表达GFP-LRRK2的HEK293细胞， 所述激酶抑制剂包括抑制细胞中主要信号转导通路的激酶抑制剂，包括PI 3-激酶、mTOR、 ERK、p38、JNK，和抑制固有免疫信号通路的激酶抑制剂(图16)。所有抑制剂按照文献中通常采用的和我们已知可抑制信号通路的浓度上限使用。正如预期的那样，10 μ M舒尼替尼诱导Ser910和Ser 935显著的去磷酸化,而所测试的32种抑制剂未显著影响Ser910/Ser935 的去磷酸化。使用相对无特异性的JNK抑制剂SP600125时观察到一些Ser910和Ser935 的去磷酸化，其中在15 μ M的浓度下使用所述JNK抑制剂SP600125，并已知与抑制JNK相比可更强地抑制许多蛋白激酶[34]。应注意的是，更强的JNK抑制剂AS601245不诱导这些位点的去磷酸化。需要进一步的工作以描述直接介导Ser910和Ser935磷酸化的蛋白激酶 (或多种蛋白激酶)。
14-3-3结合的破坏改变LRRK2的细胞定位。14_3_3蛋白的一般作用是影响其结合的蛋白的亚细胞定位。因此我们研究了 14-3-3结合是否能够影响LRRK2的细胞定位。 为了确保低水平并且尽可能均一地表达，我们生成了稳定表达野生型和非-14-3-3-结合 Ser910/Ser935突变形式的全长GFP-LRRK2的Flp-in T-REx 293细胞。免疫印迹分析显示野生型和突变GFP-LRRK2形式在相似的水平下表达(图8A)。我们接下来使用共聚焦显微术研究了细胞定位，发现与先前的报导一致[18]，野生型LRRK2均匀地分布在整个细胞溶质中并排除在细胞核外(图8B)。相反地，非-14-3-3-结合的LRRK2 [S910A]、LRRK2 [S935A] 和LRRK2[S910A+S935A]突变体在胞质池中蓄积(图8B)。
41种LRRK2疾病相关突变体的14_3_3结合的表征。我们接下来决定研究41种帕金森氏病形式的LRRK2的Ser910/Ser935磷酸化和14_3_3结合特性。图9插图显示所分析的LRRK2中的不同突变的定位。我们在293细胞中表达了具有N-端Flag表位标签的 LRRK2的全长野生型和突变形式。对LRRK2进行免疫沉淀并通过定量LICOR-免疫印迹分析测定蛋白水平。将相似水平的LRRK2类型进行免疫印迹分析，显示大部分突变体在Ser910 和Ser935发生与野生型酶程度类似的磷酸化，并与14_3_3相互作用(图9，下部画面)。然而，Ser910/Ser935 磷酸化在四种突变体中消除(R1441G、Y1699C、E1874stop 和 I2020T)，因此14-3-3结合也在四种突变体中消除(图9，下部画面)。Ser910/Ser935的磷酸化和14_3_3 结合在六种其它突变体中(M712V、R1441H、R1441C、A1442P、L1795F和G2385R)显著降低(图9,下部画面)。
我们也采用LRRKtide肽底物比较了 41种LRRK2突变形式的相对的蛋白激酶特异性活性[9](图5)。与之前的工作一致[7-9]，LRRK2[G2019S]突变体的特异性活性比野生型LRRK2高 3倍。两种其它突变体LRRK2[R1728H]和LRRK2 [T2031S]也显示活性分别比野生型LRRK2升高二和四倍。除了 R1874stop突变缺乏激酶结构域从而无活性的，所测试的所有其它突变体均具有与野生型LRRK2相似的活性。
在LRRK2[R1441C]敲入的小鼠中14_3_3与内源性LRRK2的结合被破坏。为了获得LRRK2[R144C]帕金森氏病突变破坏14_3_3结合的进一步证据，我们比较了与内源性 LRRK2结合的14-3-3的水平，所述内源性LRRK2来自先前报导的同窝出生的野生型和纯合型LRRK2 [R144C]敲入小鼠[19]。将LRRK2从各基因型的三只分别的小鼠的脾脏、肾脏和脑中免疫沉淀。免疫印迹和14-3-3加层分析证明LRRK2表达的水平在野生型和敲入小鼠中相似，然而与野生型相比，在来自LRRK2 [R1441C]敲入小鼠的组织中的Ser910/Ser935磷酸化和结合14-3-3的水平显著降低(图10)。在肾脏中观察到最大的突变影响。
41种LRRK2突变形式的细胞定位。为了确保低水平并且尽可能均一地表达野生型和全长GFP-LRRK2的突变形式，我们生成了稳定表达野生型和突变形式的全长GFP-LRRK2 的Flp-in T-REx 293细胞。免疫印迹分析显示GFP-LRRK2形式在相对类似的水平下表达 (图11A)。野生型、激酶死亡和所研究的许多其它LRRK2突变体的定位均匀地分布于整个细胞质中并排除在细胞核外，未观察到在胞质池内蓄积(参见图IlB或图13以查看更大的图像)。令人惊讶的是，显示Ser910/Ser935磷酸化和与14-3-3结合降低的大部分突变体在胞质池中蓄积(1 1441(、1 14416、1 1441!1、41442 、￥1699(、1^1795 、120201')。除显示弥散的胞质定位的截短E1874stop突变体以外，仅有两个其它突变体(M712V和G2385R)显示Ser910/ Ser935磷酸化和14_3_3结合降低(图9)但未在胞质池中蓄积(图IlB或图13)。仅发现一个突变体(R1067Q)与14-3-3相互作用并在胞质池中蓄积(图IlB或图13)。
14-3-3结合的破坏改变LRRK2的细胞定位。如此实施例所示的，不与14_3_3相互作用的LRRK2的突变体在胞质聚集物中蓄积，而不是弥散地定位于整个细胞质中。这促使我们研究H-1152处理是否诱导GFP-LRRK2或GFP-LRRK2 [G2019S]胞质再定位到离散的胞质池(图14)。我们采用在低水平下表达GFP-LRRK2或GFP-LRRK2[G2019S]的药物敏感或耐药(A2016T突变体)形式的稳定可诱导的T-REx细胞系。在未处理的细胞中，GFP-LRRK2和GFP-LRRK2[G2019S]弥散性地定位于整个细胞质中，并且未在细胞核中观察到(图14A)。然而，H-1152处理诱导LRRK2在胞质池中明显蓄积(图14A)。与通过抑制LRRK2激酶活性介导的H-1152的该作用一致的是，以H-1152处理表达耐药性LRRK2 [A2016T]或LRRK2 [A2016T+G2019S]的细胞后，未观察到胞质池蓄积(图 4A)。作为进一步对照，我们研究了不与14-3-3结合并且之前显示在胞质池内蓄积的 GFP-LRRK2[R1441C]和 GFP-LRRK2 [Y1699C]的定位[此实施例；33]。我们证实了以 H-1152 处理之后，这些突变体在胞质池样结构中蓄积，所述胞质池样结构与所观察到的GFP-LRRK2 和GFP-LRRK2[G2019S]的胞质池样结构相似(比较图14A和图14B)。
讨论
本文的主要发现是LRRK2的激酶活性间接控制Ser910/Ser935的磷酸化，从而控制14-3-3结合以及LRRK2胞质定位。在我们所研究的细胞系中(Swiss 3T3 (图4)和 HEK-293 (图5))，通过以结构不同的H-1152和舒尼替尼LRRK2抑制剂处理，可使LRRK2在 Ser910和Ser935的磷酸化发生逆转，从而使其与14_3_3的结合发生逆转。我们也发现 H-1152诱导LRRK2在离散的胞质池中蓄积，所述胞质池与所观察到的不与14_3_3结合的 LRRK2突变体的胞质池相似(图14B)。由于LRRK2抑制剂对于诱导耐药性LRRK2 [A2016T]突变体的去磷酸化或再定位是无效的，因此我们推断去磷酸化和胞质再定位是由LRRK2激酶活性的抑制引起的(图5)。H-1152和舒尼替尼在诱导LRRK2[G2019S]的Ser910/Ser935去磷酸化时比野生型LRRK2更强的这一研究结果(图5)也与这些药物在抑制LRRK2[G2019S] 时比野生型LRRK2强二至四倍一致[8]。
我们证明了 14-3-3同工型与内源性LRRK2相互作用，并且这由Ser910和Ser935 的磷酸化介导。14-3-3蛋白与许多细胞内蛋白动态地相互作用，该作用对多种细胞过程产生广泛的影响。它们通过与靶蛋白上的特异性磷酸化的残基结合而发挥作用。由于910 和935磷酸化位点周围的残基不粘附到14-3-3相互作用一般模式的最佳模式I和2保守结合基序，因此不能通过分析一级序列来预测LRRK2与14-3-3同工型相互作用这一发现 [11，15]。然而，许多与14-3-3相互作用的蛋白可通过多种不可预测的非典型结合基序结合，可能由于其它结构特征有助于相互作用[11]。
在我们所研究的全部细胞系中(Swiss 3T3 (图4)和HEK-293 (图5))，通过以结构不同的H-1152和舒尼替尼LRRK2抑制剂处理细胞，可使LRRK2在Ser910和Ser935的磷酸化发生逆转，从而使与14-3-3的结合发生逆转。由于H-1152和舒尼替尼对于诱导耐药性LRRK2[T2016A]突变体的去磷酸化是无效的，因此我们推断去磷酸化是由LRRK2激酶活性的抑制引起的(图5)。此外，H-1152和舒尼替尼在诱导LRRK2[G2019S]的去磷酸化时比野生型LRRK2更强(图5)，这与这些药物在抑制LRRK2[G2019S]时比野生型LRRK2强二至四倍一致。
关键问题涉及LRRK2控制Ser910和Ser935磷酸化的机理。一种可能性是Ser910 和Ser935包括直接LRRK2自身磷酸化位点。然而，我们的数据表明在以镁-ATP温育后，从 H-1152或舒尼替尼处理的细胞中分离的去磷酸化的LRRK2不能在Ser910/Ser935对其自身进行磷酸化(图6)。这与与丝氨酸残基相比LRRK2明显倾向于磷酸化苏氨酸残基是一致的， 如我们在最佳的肽底物中将磷酸化的Thr残基替换为Ser残基可消除LRRK2引起的磷酸化的研究结果所证明的那样[8]。此外，针对定位LRRK2自身磷酸化位点的许多研究未确定 Ser910或Ser935[16-18]。一个全球性的黑色素瘤的磷酸化蛋白质组学研究确定了 LRRK2 在Ser935的磷酸化，所述Ser935作为在2250个蛋白上记载的5600个磷酸化位点之一，但未对此进行进一步研究[19]。
Ser910和Ser935周围的序列具有显著的相似性，这表明单个蛋白激酶可磷酸化这两种残基(图3G)。我们的研究结果的一个含义是LRRK2可刺激Ser910/Ser935激酶和/ 或LRRK2可抑制作用于这些残基的蛋白磷酸酶(或多种蛋白磷酸酶)。在未来的工作中，确定作用于Ser910和Ser935的激酶(或多种激酶)和/或蛋白磷酸酶(或多种蛋白磷酸酶)并确定其是否被LRRK2控制将是非常重要的。
我们的数据表明由于Ser910或Ser935的突变会消除14_3_3相互作用，因此需要 Ser910和Ser935两者的磷酸化以使14_3_3与LRRK2结合时具有稳定的相互作用。14_3_3 分子与具有与磷酸化的残基相互作用能力的每个单体形成二聚体[15]。因此，14-3-3 二聚体具有与两个磷酸化残基相互作用的能力。一个14-3-3的二聚体可能与磷酸化的Ser910 和磷酸化的Ser935两者相互作用。我们也观察到Ser910或Ser935突变为Ala残基可诱导其它残基显著去磷酸化(图3E)。如果14-3-3结合可保护LRRK2免受蛋白磷酸酶的去磷酸化则可解释该现象。因此通过Ser910或Ser935突变消除14_3_3结合可促进其它位点28的去磷酸化。已显示14-3-3与其它靶点如磷脂酰肌醇4-激酶III β [20]或Cdc25C[21] 结合可能通过将磷酸化的残基与蛋白磷酸酶空间屏蔽来保护这些酶免于去磷酸化。
14-3-3蛋白在42年前最初确定为在脑中高度表达的酸性蛋白[31]。从那时起， 14-3-3蛋白涉及多种神经学疾病包括帕金森氏病的调节[26，27]。例如，14-3_3η与在常染色体隐性遗传性青少年型帕金森症中突变的泊蛋白结合，并负向调节其Ε3连接酶活性 [22]。14-3-3蛋白与α-突触核蛋白相互作用[23]，并在患有帕金森氏病的患者脑内的路易体中发现14-3-3蛋白[24]。此外，最近显示14-3-3 θ、ε和γ在基于细胞的神经毒性模型中抑制α-突触核蛋白过表达的毒性作用[25]。由于41个所研究突变中的10个惊人地显示Ser910/Ser935磷酸化和与14_3_3同工型结合降低，因此我们的数据表明14_3_3 与LRRK2结合可能与帕金森氏病有关(图12)。
由于Ser910和/或Ser935的突变不影响LRRK2催化活性，因此我们的数据表明 14-3-3相互作用不控制LRRK2蛋白激酶活性(图3D)。此外，以H-1152或舒尼替尼处理细胞诱导Ser910和Ser935的去磷酸化以及破坏14_3_3结合，但不影响内源性LRRK2激酶的活性(图6)。14-3-3与LRRK2的结合可能影响其与底物或与其它调节剂的相互作用，或可能影响LRRK2稳定性或细胞定位。由于Ser910/Ser935突变引起的14_3_3 结合的破坏导致LRRK2在胞质池中聚集，因此我们的实验表明14-3-3结合会影响LRRK2的胞质定位。先前的工作显示当LRRK2突变体，含有LRRK2[R1441C]和LRRK2 [Y1699C]在细胞中表达时，会聚集在胞质池中[33，35，36]，这是我们在该研究中能够证实的研究结果(图IlB或图13)。 认为这些胞质池包括错误折叠的不稳定LRRK2蛋白的聚集体[35]。如果是这样的话，这可以表明14-3-3在稳定LRRK2中起着重要作用。值得注意的是，我们发现在野生型LRRK2和所分析的大部分其它LRRK2突变体与14-3-3结合并且不在胞质池中聚集的条件下，聚集于胞质池中的八个突变体中的七个显示Ser910/Ser935磷酸化和与14_3_3的结合降低(图 11B)。通过证明Ser910/Ser935磷酸化和14_3_3结合在来自显示多巴胺能神经传递受损的纯合的R1441C敲入小鼠的三个小鼠组织中显著降低，我们也验证了这些研究结果[37]。
在图12中，根据在该研究中所分析的突变对蛋白激酶活性、Ser910/Ser935磷酸化和14-3-3结合以及细胞定位的影响，我们将我们已分析的41种LRRK2突变细分为六组。所分析的41种突变中，仅有三种使LRRK2蛋白激酶显著提高二至四倍。令人惊讶地， LRRK2 [T2031S]突变比LRRK2 [G2019S]突变体活性更高，显示比野生型LRRK2活性高近4倍的活性。仅在一个具有ro家族史的西班牙患者中报导了 LRRK2[T2031S]突变[38]。有趣的是，Thr2031位于LRRK2激酶结构域的T-环内，这是通过磷酸化活化许多激酶的区域。虽然我们到目前为止未能观察到在内源性或过表达LRRK2中的该位点的磷酸化，但最近的研究表明在昆虫细胞中表达的LRRK2的催化活性片段在包括Thr2031的数个残基上发生自身磷酸化[16]。我们已经发现将Thr2031改变为Ala以防止磷酸化导致活性与T2031S突变 (RJN数据未显示)相似地升高，突变为Glu以模拟磷酸化使LRRK2失活(ND数据未显示)。 有必要的进行进一步的工作以了解Thr2031的作用以及其突变为Ser和/或磷酸化或其它共价修饰如何影响LRRK2催化活性。LRRK2 [R1728H]突变显示激酶活性升高2倍，并在一个具有H)家族史的患者中识别到[39]。Argl728残基位于COR结构域中的激酶结构域外(图 9)。
在图7中，我们提出了一个模型，通过所述模型使Ser910和Ser935的磷酸化依赖于LRRK2活性并介导与14-3-3同工型的结合。LRRK2在SedlO和Sei*935的磷酸化或 14-3-3结合可有效地用作基于细胞的读出，以评价所开发的LRRK2抑制剂的相对效能。该试验可有效地用于以LRRK2抑制剂处理的细胞系或动物或人类组织。对于在临床试验中给予了 LRRK2抑制剂的人类患者，血液中的LRRK2在SedlO和Ser935的磷酸化状态可用作 LRRK2疗效的生物标志物(由于LRRK2在血细胞中强烈表达)。我们相信这是第一个简单的基于细胞的系统，可基于测定内源性LRRK2靶点的磷酸化而用于评估LRRK2蛋白激酶抑制剂的疗效。
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1.一种用于评估试验化合物对基于细胞的系统中的LRRK2的作用的方法，所述方法包括步骤a)评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的Ser910和/ 或Ser935的磷酸化状态的作用；和/或b)评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2与14_3_3多肽结合的作用。
2.根据权利要求I所述的方法，其中该方法包括，或进一步包括评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的亚细胞定位的作用的步骤。
3.根据权利要求I或2所述的方法，进一步包括选择认为对基于细胞的系统中的 LRRK2具有抑制作用的化合物的步骤，其中，如果LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化在暴露后降低；和/或LRRK2与14-3-3多肽的结合在暴露后降低；和/或胞质池中的LRRK2 的蓄积在暴露后降低，则选择该试验化合物。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的方法，其中，Ser910的磷酸化是使用特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体来评估的。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，其中，Ser935的磷酸化是使用特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体或特异性结合于Ser935未磷酸化的LRRK2的抗体来评估的。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的方法，其中，LRRK2与14_3_3多肽的结合是使用荧光共振能量转移(FRET)评估的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基于细胞的系统为体外细胞系统。
8.根据权利要求I至6中任一项所述的方法，其中，所述基于细胞的系统为离体细胞系统。
9.根据权利要求I至6中任一项所述的方法，其中，所述基于细胞的系统为体内系统。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，在试验动物中将所述包括LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，对取自试验动物的细胞进行对LRRK2的 Ser910和/或Ser935的磷酸化状态的评估；和/或对LRRK2与14_3_3多肽结合的评估； 和/或对胞质池中LRRK2蓄积的评估。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述取自试验动物的细胞为取自试验动物血液的细胞。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基于细胞的系统为破碎的细胞系统。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基于细胞的系统为基于淋巴样干细胞的系统。
15.特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser935磷酸化的 LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser910未磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser935 未磷酸化的LRRK2的抗体。
16.包括两种或多种以下物质的试剂盒1)特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser910未磷酸化的 LRRK2的抗体；2)特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser935未磷酸化的 LRRK2的抗体；3)14-3-3多肽，或特异性结合于14-3-3多肽的抗体；和4)荧光标记的LRRK2多肽，或编码荧光标记的LRRK2的多核苷酸。
17.以下物质在用于评估试验化合物对基于细胞的系统中的LRRK2的作用的方法中的应用1)特异性结合于Ser910磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser910未磷酸化的 LRRK2的抗体；2)特异性结合于Ser935磷酸化的LRRK2的抗体；或特异性结合于Ser935未磷酸化的 LRRK2的抗体；3)14-3-3多肽，或特异性结合于14-3-3多肽的抗体；和/或4)荧光标记的LRRK2多肽，或编码荧光标记的LRRK2的多核苷酸。
18.—种纯化的制备物或试剂盒，其包括一种LRRK2多肽或多核苷酸或特异性结合于 LRRK2的抗体；和一种14-3-3多肽或多核苷酸或特异性结合于14_3_3多肽的抗体。
19.一种表征LRRK2突变体的方法，例如在患有帕金森氏病的患者体内发现的LRRK2突变体，所述方法包括步骤a)评估LRRK2突变体的Ser910和/或Ser935的磷酸化状态；和/或b)评估LRRK2突变体与14-3-3多肽结合的能力。
20.根据权利要求19所述的方法，其中当在基于细胞的系统中表达时，所述方法包括， 或进一步包括评估LRRK2突变体的亚细胞定位的步骤。
全文摘要
用于评估试验化合物对基于细胞的系统中的LRRK2的作用的方法，所述方法包括步骤a)评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化状态的作用；和/或b)评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2与14-3-3多肽结合的作用。该方法可包括或进一步包括评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的亚细胞定位的作用的步骤。认为该方法可用于评估公认的基于细胞的系统中的LRRK2抑制剂，包括体内系统中的LRRK2抑制剂。
文档编号G01N33/573GK102947339SQ201180030200
公开日2013年2月27日 申请日期2011年4月19日 优先权日2010年4月19日
发明者D·阿莱西, R·J·尼克尔斯, N·泽姆科 申请人:医学研究理事会