专利名称：艰难梭菌外毒素a检测试剂盒及组成该试剂盒的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及艰难梭菌外毒素A检测试剂盒及组成该试剂盒的单克隆抗体。
背景技术：
艰难梭菌是一种革兰氏染色阳性、有芽胞、专性厌氧的梭状杆菌。当前，艰难梭菌感染的预防、诊断、治疗面临着重重困难。一方面，艰难梭菌广泛存在于院内环境中，而且作为其休眠形式的芽胞能够耐受多种院内常用的消毒剂，它已经成为仅次于弯曲杆菌的院内感染性腹泻的主要病原体；甲硝唑、万古霉素，作为治疗艰难梭菌感染的两种主要的药物， 它们的耐药性也在不断地累积、传播，疗效日趋降低，而且对于复发病例的治疗，这两种药物呈现出无能状态。另外一方面，到目前为止，尚无有效的、商品化的疫苗问世；基于毒素的 ELISA检测试剂盒价格昂贵，难以对艰难梭菌进行临床常规检测，也不适用于大规模的流行病学调查和长期监测；治疗性抗体作为一种安全、有效、廉价的抗生素替代品，前景光明却依然处于探索期。所以，急需开发安全、有效、方便、廉价的艰难梭菌疫苗来保护高危人群， 在疫苗的基础上开发相应的单克隆抗体，为诊断试剂及治疗性抗体提供可能。艰难梭菌通过粪口途径进入消化道，继而分泌外毒素而导致腹泻。毒素A既是一种肠毒素，又是一种细胞毒素，是艰难梭菌致病的主要毒力因子之一。研究发现，艰难梭菌外毒素A只有当其羧基端与靶细胞表面受体结合后才能够发挥毒性作用；艰难梭菌外毒素 A的分子表面结构大部分为其羧基端所覆盖；针对艰难梭菌外毒素A羧基端的抗体，能有效抑制其肠毒性和细胞毒性，具有保护效应。所以，艰难梭菌外毒素A羧基端是疫苗研究和抗体开发的理想结构域。DNA免疫是近年发展起来的一种新型抗体制备法。DNA免疫克服了传统蛋白质免疫方法的缺陷，能更为有效地激活机体的体液和细胞免疫应答。首先是在仅知DNA编码而不能获得目的蛋白，或获得的蛋白为低免疫性的情况下，通过DNA免疫可产生高效价特异性的抗体，这为单抗制备提供了一种简单易行的方法。同时DNA免疫因为存在体内抗原表达和递呈的过程，所以它最接近活细菌感染机体免疫反应过程并且很完整保存了抗原构象，由此产生的抗体对构想表位有更好的特异性，因此增加了得到具有中和抗体活性单抗的可能性。DNA免疫制备单抗为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测艰难梭菌外毒素A的试剂盒。本发明的另一目的是提供组成该试剂盒的两株单克隆抗体。本发明的又一目的是提供所述两株单克隆抗体的应用。本发明的目的通过如下技术方案实现一种检测艰难梭菌外毒素A的试剂盒，包含两种识别不同表位的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，分别为保藏号为CGMCC No. 4979的杂交瘤细胞产生的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体以及保藏号为CGMCC No. 4980的杂交瘤细胞系产生抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体。所述的辣根过氧化物酶标记的由保藏号为CGMCC No. 4980的杂交瘤细胞系产生抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体的稀释度为I : 2000。分泌抗艰难梭菌外毒素A羧基端单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No. 4979，保藏日期为2011年6月23日。一种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No. 4979的杂交瘤细胞系产生。所述的单克隆抗体在制备艰难梭菌外毒素的诊断试剂中的应用。所述的单克隆抗体在制备治疗艰难梭菌外毒素感染的药物中的应用。分泌抗艰难梭菌外毒素A羧基端单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No. 4980，保藏日期为2011年6月23日。一种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No. 4980的杂交瘤细胞系产生。所述的单克隆抗体在制备艰难梭菌外毒素的诊断试剂中的应用。所述的单克隆抗体在制备治疗艰难梭菌外毒素感染的药物中的应用。本发明的有益效果I、目前，国内尚无合适的检测艰难梭菌感染的诊断试剂盒，而国际上已研发成功的试剂盒价格昂贵，这也阻碍了国内艰难梭菌诊断的发展，本发明提供的艰难梭菌外毒素检测试剂盒，通过使用两株高亲和力的配对单抗，使检测艰难梭菌的灵敏度达到了国际标准。这一试诊断试剂盒的开发可极大的促使国内开展广泛艰难梭菌的研究，同时也可以对艰难梭菌感染进行大规模的流行病学调查和长期的监测。2、本发明以选取艰难梭菌外毒素A基因羧基端末尾978个碱基序列为研究模板，对该序列进行密码子优化处理，设计得到TcdA-C基因序列，并将该优化后的序列装入 PJW4303载体中，构建一密码子优化的TcdA-C基因的DNA疫苗。用该DNA疫苗通过电穿孔免疫小鼠，经过常规细胞融合、筛选及单克隆化，建立稳定分泌抗TcdA-C单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用捕获ELISA方法进行筛选，杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异性识别商品化toxinA及艰难梭菌分泌的外毒素A。捕获ELISA较之直接包被ELISA方法主要有几方面的优势a.抗原以自然状态与特异性抗体结合；b.敏感性高；c.检测信号的强弱较大程度上依赖于抗体的捕获能力，换言之，这种方法能筛选出试剂盒所需的具有高亲和力的抗体。通过捕获法筛选获得的2株高亲和力的单抗进行配对，其对抗原的检测灵敏度达到国际市场上应用最广的3家艰难梭菌检测试剂盒的灵敏度，这对艰难梭菌感染的诊断，治疗及疫苗制备等具有重要意义。3、虽然新近已有针对外毒素A羧基端的治疗性单克隆抗体问世，但仍处在早期临床试验阶段，所呈现的治疗效果也有一定的局限性。我们制备多株高亲和力的单抗在CHO 细胞上的被动保护试验呈现保护作用，通过人源化后可用于开发安全、有效、廉价的治疗性抗体。生物材料保藏信息
I、杂交瘤细胞株5D8D5，分类命名为杂交瘤细胞株SP2/0，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 4979，保藏日期为2011年6月23日。2、杂交瘤细胞株2C7B6，分类命名为杂交瘤细胞株SP2/0，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 4980，保藏日期为2011年6月23日。
图I单抗在细胞水平的中和保护试验结果照片。A为空白细胞对照，B为未加单抗仅加毒素的细胞对照，C为15ug/ml 2C7B6与毒素共同作用，D为15ug/ml 5D8D5与毒素共同作用。
具体实施例方式实施例L DNA疫苗pJW4303-TcdA_C的构建详见申请号为2010101309048的中国发明专利申请说明书实施例I 4。实施例2. 293F细胞转染293F 细胞(购自 invitrogen 公司，cat No. R790-07)用含 293F 细胞培养基 37°C， 5% CO2饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，转染前一天接种细胞6 7xl05cells/ml,转染当天,取少量细胞计数,细胞数约为 lxl06cells/ml,准备 Iipid-DNA 复合物。a.用 opti-MEM I 稀释 30ug pJW4303-TcdA_C 质粒至 1ml,轻轻混勻。b.用opti-MEM I稀释60ul 293fectin至1ml,轻轻混勻并室温孵育5Min。c.将步骤a制备的pJW4303-TcdA_C质粒稀释液加入到293fectin中，轻轻混匀。d.室温孵育 20_30mins，得 DNA/293fectin。然后将DNA/293fectin加入到摇瓶中，转染48_72h，然后收集上清储存于_80°C备用。脾细胞融合前4天用该上清免疫小鼠进行蛋白质加强。实施例3.杂交瘤细胞系的建立步骤I :动物免疫用实施例I制备的pJW4303-TcdA-C免疫7只Balb/c小鼠。肌肉注射结合活体基因导入方式免疫，保证针头插入深度2mm，注入疫苗，观察注射局部隆起，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(技术参数电压50V，脉冲次数正反各3 次，波宽60ms，频率30Hz)，以小鼠腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0、2、4、8周进行4次DNA免疫，第4次DNA免疫后采用腹腔注射pJW4303-TcdA-C转染293F细胞上清粗提物，每只小鼠注射O. 2mg蛋白。步骤2:细胞融合在步骤I蛋白加强免疫4天后，摘除免疫小鼠眼睛放血，留取血清作为ELISA的阳性对照。拉颈处死小鼠，75%酒精浸泡5min。在小鼠腹部剪一小口，撕开皮肤，剪开腹膜，镊取小鼠脾脏，剪下小鼠脾脏，除去脂肪和结缔组织，用RPMI 1640不完全培养基洗涤小鼠脾脏。将小鼠脾脏剪成4块，在不锈钢筛网(100目/cm2)上，用玻璃注射器针芯充分研磨小鼠脾脏，轻轻挤压出脾细胞。将研磨液经过不锈钢筛网(200目/cm2)过滤后，转移至离心管，IOOOrpm离心5min，弃上清。RPMI 1640不完全培养基洗涤细胞一次，再用RPMI 1640不完全培养基充分重悬细胞，进行细胞计数，置于孵育箱(37°C、5%C02)中待用。充分混匀免疫脾细胞IO8个(25ml无血清培养基)和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞(购自上海细胞所)2xl07 个(25ml无血清培养基)悬液，200-400g离心5_10min，用吸管尽可能吸取上清，以免稀释 PEG.。手指轻弹离心管使细胞沉淀较为松动，将离心管置于37°C水浴中，融合过程中离心管一直置于水浴中，I分钟内使用吸管将Iml 37°C水浴中预热的50% PEG1500加入到细胞沉淀中，边加边适度搅拌，加完后继续搅拌l_2min。I分钟内加lml37°C水浴中预热的培养基到融合混合物中，如上述搅拌。3分钟内加3ml预热的培养基，持续搅拌，然后缓慢的加入IOml预热的培养基，离心沉淀细胞，弃上清，用选择性培养基(RPMI 1640,10% FBS, lxGlutamine/Pen/Strep, IxHAT medium)重悬细胞沉淀,按100 μ I/孔加入到96孔培养板， 置于细胞孵育箱(37°C、5%C02)中培养。在融合后第5和第7天更换新鲜培养基，在第7 天或第10天检测抗体分泌情况。步骤3 :捕获ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞I)准备5ug/ml抗小鼠IgG-Fc (购自Sigma公司)，每孔加IOOul, 4°C,过夜。2)弃包被液，用IXPBST洗板2次。3) 5 % 脱脂奶粉(PBS，O. 05 % Tween-20, 5 % 脱脂奶粉)37 °C，封闭 lh，每孔 200 μ I。4)弃封闭液，用IXPBST洗板2次。5) 一抗为待检测融合细胞上清，每孔加入100μ 1，37°C，孵育Ih。6)弃一抗，用IXPBST洗板5次。7) 二抗为生物素标记商品化全毒素toxinA(购自List BioLab公司)(浓度为 100ng/ml)，每孔加入 100 μ 1，RTlh08)弃二抗，用IXPBST洗板5次。9)!11^标记链亲和素(浓度为111^/1111，1 2000)，每孔加入100 μ 1，37°C，孵育lh。10)弃HRP标记链亲和素，用IXPBST洗板5次。11)TMB 显色(100ul/well)，室温，3. 5min，50ul/well IM 的 H2SO4 终止显色。12)酶标仪测定并记录各孔A450值。步骤4 :阳性杂交瘤细胞的克隆化-采用有限稀释法将细胞悬液移至刻度离心管中连续倍数稀释。例如，先制备5xl03细胞悬液，将此细胞悬液经100倍稀释，即为50细胞/ml ;再将50细胞/ml的细胞悬液经5倍稀释，即为 10细胞/ml，最后将10细胞/ml的细胞悬液经2倍稀释，即为5细胞/ml。将3种稀释好的细胞悬液分别接种于96孔板中，每孔加IOOul。50细胞/ml加到A，B，C三排，细胞数为 10个/ml加D、E、F三排。细胞数5个/ml，加G、H两排。约10天后检测抗体，筛选出抗体阳性最强的单克隆细胞。然后，再进行亚克隆培养，改用RPMI 1640完全培养基，直到所有含单个克隆的微孔均为抗体阳性为止，即获得单抗分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定，从何获得了 6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 分别为 OT8D5，2C7B6，1G3F10, 2D4D3,1B5F5 和 4A4F2，液氮冻存待用。实施例4体外培养法制备单抗
将实施例3建立的阳性杂交瘤细胞 8D5，2C7B6，1G3F10, 2D4D3,1B5F5，和4A4F2 进行扩大培养，收集培养上清1500rpm，离心lOmin，上清含有高浓度的单克隆抗体，-70°C
保存备用。实施例5单抗特性鉴定步骤I :克隆抗体IgG亚型鉴定取6株杂交瘤细胞培养上清，按照小鼠单克隆抗体同型检测试剂盒操作说明(HBT 公司)进行操作。具体方法如下(I)加500ul缓冲液至检测管中；(2)加500ul杂交瘤细胞培养上清至检测管中；(3)完全浸润试纸条，并轻轻摇动；(4)加入Iml大鼠抗小鼠K链底物至检测管中，试纸条打印面朝下，与液体充分接触，轻轻摇动直至试纸条上出现两条带；结果表明1G3F10为 IgGl，K 轻链免疫球蛋白；5D8D5, 2C7B6,1B5F5，2D4D3 和 4A4F2为IgG2a，K轻链免疫球蛋白。步骤2:单克隆抗体的纯化利用GE HiTrap protein G抗体纯化柱(Iml柱)进行单抗纯化,具体操作如下(I)将注射器中充满结合缓冲液，除去堵头并将注射器连接在柱子上(使用提供的连接接头)，缓冲液需一滴一滴注如以避免出现气泡；(2)除去柱子底部出口的堵头；(3)使用至少5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子；(4)使用注射器将样品上到柱子上去，为了获得良好的结果，推荐的流速为O. I lml/min ；(5)以7倍柱体积的缓冲液冲洗柱子，或直到没有物质从柱子中流出。在冲洗时保持流速为2ml/min。(6)以IOml洗脱缓冲液洗脱蛋白，在洗脱时，保持流速为lml/min。(7)洗脱完毕后，用5倍的结合缓冲液冲洗柱子，这样柱子可以用于新的一轮纯化过程。步骤3 :单克隆抗体稳定性的测定复苏杂交瘤细胞，收集不同传代次数(传代次数高达20次以上)的细胞上清，并用ELISA方法检测其效价。结果表明获得6株杂交瘤细胞株能够稳定的产生单克隆抗体。实施例6.不同单抗配对特性的检测以及试剂盒的前期基础研究步骤I :6株单克隆抗体配对后进行检测其灵敏度按下列模式设计该试验，本试验目的是为了检测不同的配对优劣，选出检测灵敏度最好的一对单抗。组I :包被 1G3F10，用 C7B6-HRP，2D4D3-HRP，1B5F5-HRP, 4A4F2-HRP 进行检测组2 :包被 OT8D5，用 2C7B6-HRP，2D4D3-HRP，1B5F5-HRP, 4A4F2-HRP 进行检测组3 :包被 2C7B6，用 1G3F10-HRP，5D8D5-HRP 进行检测组4 :包被 2D4D3，用 1G3F10-HRP，5D8D5-HRP 进行检测组5 :包被 1B5F5，用 1G3F10-HRP，5D8D5-HRP 进行检测
组6 :包被 4A4F2，用 1G3F10-HRP，5D8D5-HRP 进行检测操作步骤I)准备5ug/ml抗体进行包被，每孔加IOOul，4°C，过夜。2)弃包被液，用IXPBST洗板2次。 3)5% 脱脂奶粉(PBS ,0. 05% Tween-20，5 % 脱脂奶粉)37 °C，封闭 Ih，每孔 200 μ L·4)弃封闭液，用IXPBST洗板2次。5)按表I加入ToxinA,室温孵育lh。表I
权利要求
1.一种检测艰难梭菌外毒素A的试剂盒，其特征在于包含两种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，分别为保藏号为CGMCC No. 4979的杂交瘤细胞产生的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的由保藏号为CGMCC No. 4980 的杂交瘤细胞系产生的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的检测艰难梭菌外毒素A的试剂盒，其特征在于所述的辣根过氧化物酶标记的由保藏号为CGMCC No. 4980的杂交瘤细胞系产生抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体的稀释度为I : 2000。
3.分泌抗艰难梭菌外毒素A羧基端单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No. 4979，保藏日期为2011年6月23日。
4.一种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，由权利要求3所述的保藏号为 CGMCC No. 4979的杂交瘤细胞系产生。
5.权利要求4所述的单克隆抗体在制备艰难梭菌外毒素的诊断试剂中的应用。
6.权利要求4所述的单克隆抗体在制备治疗艰难梭菌外毒素感染的药物中的应用。
7.分泌抗艰难梭菌外毒素A羧基端单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No. 4980，保藏日期为2011年6月23日。
8.一种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，由权利要求7所述的保藏号为 CGMCC No. 4980的杂交瘤细胞系产生。
9.权利要求8所述的单克隆抗体在制备艰难梭菌外毒素的诊断试剂中的应用。
10.权利要求8所述的单克隆抗体在制备治疗艰难梭菌外毒素感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了艰难梭菌外毒素A检测试剂盒及组成该试剂盒的单克隆抗体。一种检测艰难梭菌外毒素A的试剂盒，包含两种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，分别为保藏号为CGMCC No.4979的杂交瘤细胞产生的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的由保藏号为CGMCC No.4980的杂交瘤细胞系产生的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体。本发明提供的艰难梭菌外毒素检测试剂盒，通过使用两株高亲和力的配对单抗，使检测艰难梭菌的灵敏度有了显著提高。
文档编号G01N33/577GK102590515SQ20121001166
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者卢山, 张春华, 王世霞, 金柯, 黄祖瑚 申请人:卢山, 张春华, 王世霞, 金柯, 黄祖瑚