专利名称：一种测定汞离子含量的分析方法
技术领域：
本发明涉及抗汞离子单克隆抗体的制备及一种测定食品和环境中汞离子含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于环境安全监督或食品分析的研究领域。
背景技术：
汞是一种对人体健康危害极大的重金属元素。汞离子会沉积在脑、肝和其他器官中，产生慢性中毒，损害肾、脑、胃和肠道，甚至引起死亡。另外，汞元素及其化合物如甲基汞、乙基汞等能够通过皮肤被吸收，引起口腔炎、齿龈炎和神经紊乱等疾病。汞被优先列在全球环境监控系统(GEMS)清单上，世界各国都花费大量的人力、物力和财力在开发和研究新型的检测汞离子方法。目前常用的检测汞离子的方法有原子吸收/发射光谱法、诱导等离子质谱法、原子荧光光谱法、阳极溶出伏安法等，这些方法虽然灵敏度较高，但仪器昂贵，操作复杂。酶联免疫分析方法是一种建立在抗原与抗体之间特异性反应基础上的分析方法，具有灵敏度高、特异性强、简便、快速、可同时检测大量样品的特点，已广泛应用于临床、生物、食品和环境分析领域中。目前，酶联免疫分析方法也已用于食品和环境中重金属的检测。建立检测重金属的酶联免疫分析方法的关键是制备出抗重金属离子的特异性抗体，而抗体的制备又取决于免疫原。由于重金属离子自身不能作为免疫原免疫动物，目前大多采用选择一种合适的螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和反式-环己基二乙烯三胺五乙酸(CHXDTPA)等，使之与金属离子配位，再与大分子蛋白结合，从而制备出免疫原。但这些螯合物的空间结构较大，金属离子被包裹在其中。所产生的抗体能识别重金属螯合物形成的外壳，对重金属离子本身未必识别，因此抗体的特异性不够高；另外在检测样品时，必须先加入一定量的螯合剂，使之与待测重金属离子形成能被抗体识别的重金属螯合物，从即使测定过程变得更为复杂。由于汞与巯基具有很强的结合能力，本专利选用了一种带有巯基和羧基的物质即6-巯基烟酸(MNA，分子结构见图I)作为配体，利用其上的羧基，将配体与载体蛋白连接，再利用其上的巯基与氯化甲基汞相连，生成的甲基汞-MNA-载体蛋白用作免疫原及包被抗原；运用杂交瘤抗体制备技术，经动物免疫、融合、筛选等步骤，制备出抗汞离子的单克隆抗体并对抗体各种性能作了鉴定，建立了测定汞离子的间接竞争酶联免疫分析法，并用于食品和环境样品中汞离子的检测。
发明内容
本发明的目的是制备抗汞离子的单克隆抗体，并建立一种测定食品和环境中汞离子含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是基于抗原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。
一种测定汞离子含量的分析方法，包括以下步骤步骤一免疫原和包被抗原的制备；步骤二 汞离子单克隆抗体的制备；步骤三优化实验条件，建立测定汞离子的酶联免疫吸附分析方法；步骤四ELISA对加标样品中汞离子含量的测定。其中，所述的步骤一包括取6-巯基烟酸MNA与等摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和N，N，- 二环己基碳二亚胺溶于N，N’ - 二甲基甲酰胺，反应过夜后离心，上清液缓慢加入40 SOmg牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA的碳酸氢钠溶液中，搅拌反应2 4小时后，离心，上清液用0. Olmol/L PBS溶液透析，得到MNA-BSA或MNA-OVA混合液；然后将氯化甲基汞CH3HgCl溶液缓慢滴入上述溶液，反应后混合液于0. 01mol/L的(NH4)2CO3溶液透析，冻干，于_4°C保存；其中CH3Hg-MNA-BSA 为免疫原，CH3Hg-MNA-OVA 为包被抗原。其中，所述的步骤二包括免疫、融合、筛选、单克隆抗体的生产。其中，所述的步骤三包括(I)溶液配制；(2)间接ELISA筛选单克隆抗体；(3)间接竞争ELISA步骤；(4) ELISA实验条件的优化；(5) ELISA的标准曲线及灵敏度；(6) ELISA 的特异性。其中，所述(I)溶液配制包括(I)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；(2)磷酸盐缓冲液；(3)酪蛋白溶液；(4)磷酸缓冲液-吐温储备液；(5)汞离子储备液；(6)底物溶液；(7) H2SO4 溶液；(8) RPMI-IMO 培养液。其中，所述⑵间接ELISA筛选单克隆抗体包括(a)用包被抗原以及对照抗原(MNA-OVA)包板，每孔100 U L，4°C过夜；(b)PBST缓冲液(PBST储备液I : 10稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔120iiL，4°C过夜；(d)加入杂交瘤细胞上清，每孔50 U L，37°C放置2小时；(e) PBST缓冲液洗板三次；(f)加入酶标二抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，GaMIgG-HRP)，每孔100 U L，37°C放置I小时；(g) PBST缓冲液洗板三次；
(h)加入底物液显色，每孔100 μ L,振摇15-20分钟；⑴加入5% H2SO4溶液，每孔50 μ L，终止反应；
(j)用酶标仪測定吸光度值，对比两种包被的吸光度值，进行结果分析与讨论。其中，所述(3)间接竞争ELISA步骤包括(a)用包被抗原包板，每孔200 μ L，4°C过夜；(b)PBST缓冲液(PBST储备液I : 10稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔280 μ L,室温放置I小时；(d) PBST缓冲液洗板三次；(e)依次每孔加入100 μ L的标准溶液和100 μ L的一定稀释度的单克隆抗体，室温放置I小时；(f) PBST缓冲液洗板三次；(g)加入酶标ニ抗(GaMIgG-HRP)，每孔200 μ L，室温放置I小时；(h) PBST缓冲液洗板三次；(i)加入底物液显色，每孔200 μ L，振摇15-20分钟；(j)加入5% H2SO4溶液,姆孔80 μ L,终止反应；(k)用酶标仪測定吸光度值，做出标准曲线，进行结果分析与讨论。其中，所述(4)ELISA实验条件的优化结果为包被抗原的浓度为20ng/mL，单克隆抗体的稀释度为I : 10000，酶标ニ抗的稀释度为I : 10000，实验温度在室温下进行。其中,所述(5)ELISA的标准曲线及灵敏度包括汞离子标准溶液的浓度为0，0· 1,0. 3,1.0,3. 0,10,30,100ng/mL,由汞离子的储备液I. Omg/mL经过稀释而得；平行做若干次，以汞离子浓度的对数为横坐标，以相对信号BziBtlX 100%为纵坐标做标准曲线:标液浓度为Ong/mL所对应的吸光度值；B :其他各浓度对应的吸光度值；其IC5tl为I. 12ng/mL, LOD为O. 08ng mじ1。其中，所述(6)ELISA的特异性包括ELISA特异性可用交叉反应率来表示；交叉反应率(CR% )=(汞离子的IC5tl/测试物质的IC5Q) X 100%。交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。本发明的优点I.采用了一种新的配体(MNA)，利用其上的羧基和巯基，分别与载体蛋白和氯化甲基汞相连，制备出免疫原和包被抗原；2.运用杂交瘤单抗制备技术，成功地制备出抗汞离子的单克隆抗体，并建立了测定食品和环境样品中萊尚子含量的ELISA ；3.灵敏度高、特异性強、样品处理简单、测试量大、测试费用低；4.对加标样品中Hg(II)的測定，ELISA与冷蒸汽原子荧光光谱法CV-AFS有很好的相关性。
图I.所选用配体6-巯基烟酸(MNA)的分子结构。
图2. CH3Hg-MNA的立体结构。图3. ELISA检测汞离子的标准曲线。图4. ELISA和CV-AFS对液体样品中汞离子的检测结果的相关曲线。图5. ELISA与CV-AFS检测其他加标样品中汞离子的检测结果的相关曲线。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施只用于对发明进行进ー步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容做出一些非本质的改进和调整。实施例I.免疫原和包被抗原的制备取O. 10 O. 45mmol的6_巯基烟酸(MNA)与等摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N’_ ニ环己基碳ニ亚胺(DCC)溶于100 600yL的N，N’_ ニ甲基甲酰胺(DMF)，反应过夜后离心，上清液缓慢加入40 80mg牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)的碳酸氢钠溶液中，搅拌反应2 4小时后，离心，上清液用O. 01mol/L PBS溶液透析，得到MNA-BSA(或MNA-0VA)混合液。然后将氯化甲基汞(CH3HgCl)溶液缓慢滴入上述溶液，反应后混合液于O. 01mol/L的(NH4)2CO3溶液透析，冻干，于_4°C保存。其中CH3Hg-MNA-BSA为免疫原，CH3Hg-MNA-OVA为包被抗原；2.汞离子单克隆抗体的制备免疫将免疫原溶于生理盐水中，再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，剂量在SO-IOOyg/只；以后每隔两周免疫一次，将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第三次免疫后一周，尾部取血测效价，最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂。融合最后一次加强免疫三天后取小鼠脾脏，将脾细胞与骨髄瘤细胞按5 I 10 I的比例混合，在50%聚こニ醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先加有饲养细胞的96孔培养板，置于37°C，5% CO2培养箱中培养。筛选融合后2周左右，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测。单克隆抗体的大量生产先腹腔注射液体石蜡于BALB/C小鼠，7_10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情況，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水，盐析后，加等量甘油-20°C保存。3.优化实验条件，建立測定汞离子的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立測定食品和环境中汞离子含量的ELISA。
(I)溶液配制(a)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液称取I. 606g Na2CO3 · IOH2O, 3. 434g NaHCO3,用 800mL 超纯水混匀溶解后，调节 pH值，加水至1L，配成O. 05mol/L, pH = 9. 6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；(b)磷酸盐缓冲液(储备液，PBSX 10)称取21. 961g Na2HPO4 · 12Η20，6· 031g NaH2PO4 · 2Η20，87· 666g NaCl，カロ 800mL 超纯水混合，加热溶解；用lmol/L的NaOH调节pH = 7. 4，加超纯水至1L，配成含O. 15mol/LNaCl，pH = 7. 4的O. lmol/L磷酸缓冲液(储备液);(C)酪蛋白溶液 称取酪蛋白加热溶解于O. O lmol/L的PBS中，配成O. 5 2%酪蛋白溶液；(d)磷酸缓冲液-吐温储备液(含I % Tween20的O. lmol/L磷酸缓冲储备液，PBSTX 10，pH = 7. 4)；(e)汞离子储备液称取6. 77mg氯化萊标准品,溶于5mL的2%硝酸溶液中，配成lmg/mL的萊离子储备液；(f)底物溶液(20mL纯水；ImL醋酸钠缓冲液；200 μ L四甲基联苯胺(TMB) (1%)；20 μ L过氧化氢(5% ))；①醋酸钠缓冲液称取3. 450g CH3COONa ·3Η20，用 IOOmL 超纯水溶解，再用 lmol/L 柠檬酸(21. 031gC6H8O7 · H2O溶解于IOOmL水中)调节pH = 5. 8后，再用水定容到250mL，配成0. lmol/L醋酸钠缓冲液；②四甲基联苯胺(TMB)溶液称取0. 0717g TMB，用7. 17mLニ甲基亚砜溶解，混匀，配成 I %, w/v ;③过氧化氢取20 μ L 30%的过氧化氢加入100 μ L超纯水中，混匀，配成5% ；(g)H2SO4溶液移取25mU*H2S04，溶解于475mL的超纯水中，配成5% H2SO4溶液。(h)RPMI-1640培养液RPMI_1640固体粉末10.4g溶于800ml超纯水中，加入HEPES (4-羟こ基哌嗪こ磺酸)4. 67g，并按终体积IL计算加入200mmol/L L-谷氨酸、lOOmmol/L 2-巯基こ醇及lmmol/L(即0. lg/L)丙酮酸钠，再加入10町11青霉素以及10万111链霉素，补加超纯水使终体积达1000ml，磁力搅拌3 4小时，充分溶解后再加入NaHCO3约2g调节培养液pH至7. 2 7. 4,0. 22 μ m滤器过滤除菌，无菌分装，_20°C密封保存。(2)主要仪器洗板机A5082,Tecan, Austria ;酶标仪A2082, Tecan, Austria ；高效液相色谱仪Alltech-001(3)间接ELISA筛选单克隆抗体(a)用包被抗原以及对照抗原(MNA-OVA)包板，每孔100 μ L，4°C过夜；(b)PBST缓冲液(PBST储备液I : 10稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔120yL，4°C过夜；(d)加入杂交瘤细胞上清，每孔50 μ L，37°C放置2小吋；(e) PBST缓冲液洗板三次；(f)加入酶标ニ抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，GaMIgG-HRP)，每孔100 μ L，37°C放置I小吋；(g) PBST缓冲液洗板三次；(h)加入底物液显色，每孔100 μ L,振摇15-20分钟；⑴加入5 ^iH2SO4溶液，每孔50 μ L，终止反应；(j)用酶标仪測定吸光度值，对比两种包被的吸光度值，进行结果分析与讨论。
(4)间接竞争ELISA步骤(a)用包被抗原包板，每孔200 μ L，4°C过夜；(b) PBST缓冲液(PBST储备液I : 10稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔280 μ L，室温放置I小时；(d) PBST缓冲液洗板三次；(e)依次每孔加入100 μ L的标准溶液和100 μ L的一定稀释度的单克隆抗体，室温放置I小时； (f) PBST缓冲液洗板三次；(g)加入酶标ニ抗(GaMIgG-HRP)，每孔200 μ L，室温放置I小时；(h) PBST缓冲液洗板三次；⑴加入底物液显色，每孔200 μ L，振摇15-20分钟；(j)加入5% H2SO4溶液，每孔80 μ L，终止反应；(k)用酶标仪測定吸光度值，做出标准曲线，进行结果分析与讨论。(5) ELISA实验条件的优化本发明中的包被抗原为CH3Hg-MNA-OVA,实验中对包被抗原的浓度、抗体的稀释度、酶标ニ抗的稀释度等作了优化，优化结果为包被抗原的浓度为20ng/mL，单克隆抗体的稀释度为I : 10000，酶标ニ抗的稀释度为I : 10000，实验温度在室温下进行。以后的实验均在此条件下进行。(6) ELISA的标准曲线及灵敏度汞离子标准溶液的浓度为:0,0. 1,0. 3,1.0,3. 0,10,30,100ng/mL,由汞离子的储备液(1.0mg/mL)经过稀释而得。平行做若干次，以汞离子浓度的对数为横坐标，以相对信号BziBciX 100%为纵坐标做标准曲线(Btl :标液浓度为Ong/mL所对应的吸光度值；B :其他各浓度对应的吸光度值)。图3为ELISA检测Hg(II)的标准曲线，其IC5tl为I. 12ng/mL, LOD为 O. 08ng mL、(7) ELISA 的特异性ELISA特异性可用交叉反应率来表示。交叉反应率(CR% )=(汞离子的IC5tl/测试物质的IC5tl) X 100%。交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。本发明中除了Hg(II)外，还选择了多种离子(如 Cu2+，Cr3+，Sn2+，Ni2+，Mn2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Fe3+，Co2+，Mg2+)、MNA、CH3Hg ⑴，CH3Hg-MNA 和 Hg ⑴-MNA 进行交叉反应实验。交叉反应率列于表I中。表I.单克隆抗体与 Hg(II)、MNA、CH3Hg(I)、CH3Hg-MNA, Hg(I)-MNA 及其它金属离
子的交叉反应率
权利要求
1.一种测定汞离子含量的分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 步骤一免疫原和包被抗原的制备； 步骤二 汞离子单克隆抗体的制备； 步骤三优化实验条件，建立测定汞离子的酶联免疫吸附分析方法； 步骤四=ELISA对加标样品中汞离子含量的测定。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述的步骤一包括 取6-巯基烟酸MNA与等摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和N，N’ - 二环己基碳二亚胺溶于N，N’ - 二甲基甲酰胺，反应过夜后离心，上清液缓慢加入40 SOmg牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA的碳酸氢钠溶液中，搅拌反应2 4小时后，离心，上清液用O. Olmol/L PBS溶液透析，得到MNA-BSA或MNA-OVA混合液；然后将氯化甲基汞CH3HgCl溶液缓慢滴入上述溶液，反应后混合液于O. Olmol/L的(NH4)2CO3溶液透析，冻干，于_4°C保存；其中CH3Hg-MNA-BSA 为免疫原，CH3Hg-MNA-OVA 为包被抗原。
3.根据权利要求I所述的方法，其中，所述的步骤二包括免疫、融合、筛选、单克隆抗体的生产。
4.根据权利要求I所述的方法，其中，所述的步骤三包括 (1)溶液配制； (2)间接ELISA筛选单克隆抗体； (3)间接竞争ELISA步骤； (4)ELISA实验条件的优化； (5)ELISA的标准曲线及灵敏度； (6)ELISA的特异性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(I)溶液配制包括 (1)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液； (2)磷酸盐缓冲液； (3)酪蛋白溶液； (4)磷酸缓冲液-吐温储备液； (5)萊尚子储备液； (6)底物溶液；(7)H2SO4 溶液；(8)RPMI-1640 培养液。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述⑵间接ELISA筛选单克隆抗体包括 (a)用包被抗原以及对照抗原(MNA-OVA)包板，每孔100μL，4°C过夜； (b)PBST缓冲液(PBST储备液I: 10稀释)满孔洗涤三次； (c)加入酪蛋白封阻，每孔120yL，4°C过夜； (d)加入杂交瘤细胞上清，每孔50μ L，37°C放置2小时； (e)PBST缓冲液洗板三次； (f)加入酶标二抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，GaMIgG-HRP)，每孔100μ L，37°C放置I小时； (g)PBST缓冲液洗板三次；(h)加入底物液显色，每孔100 μ L，振摇15-20分钟； ⑴加入5% H2SO4溶液，每孔50 μ L，终止反应； (j)用酶标仪测定吸光度值，对比两种包被的吸光度值，进行结果分析与讨论。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(3)间接竞争ELISA步骤包括 (a)用包被抗原包板,每孔200μ L,4°C过夜； (b)PBST缓冲液(PBST储备液I: 10稀释)满孔洗涤三次； (c)加入酪蛋白封阻，每孔280μ L，室温放置I小时； (d)PBST缓冲液洗板三次； (e)依次每孔加入100μ L的标准溶液和100 μ L的一定稀释度的单克隆抗体，室温放置I小时； (f)PBST缓冲液洗板三次； (g)加入酶标二抗(GaMIgG-HRP)，每孔200μ L，室温放置I小时； (h)PBST缓冲液洗板三次； (i)加入底物液显色，每孔200μ L，振摇15-20分钟； (j)加入5% H2SO4溶液，每孔80 μ L，终止反应； (k)用酶标仪测定吸光度值，做出标准曲线，进行结果分析与讨论。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(4)ELISA实验条件的优化结果为 包被抗原的浓度为20ng/mL，单克隆抗体的稀释度为I : 10000，酶标二抗的稀释度为I 10000，实验温度在室温下进行。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(5)ELISA的标准曲线及灵敏度包括 汞离子标准溶液的浓度为0，0. 1,0. 3,1.0,3. 0,10,30,100ng/mL,由汞离子的储备液I. Omg/mL经过稀释而得；平行做若干次，以汞离子浓度的对数为横坐标，以相对信号B/BtlX 100%为纵坐标做标准曲线Jtl :标液浓度为Ong/mL所对应的吸光度值；B :其他各浓度对应的吸光度值；其IC5tl为I. 12ng/mL, LOD为O. OSngmL'
10.根据权利要求4所述的方法，其中，所述￠)ELISA的特异性包括 ELISA特异性可用交叉反应率来表示； 交叉反应率CR%=(汞离子的IC5c/测试物质的IC5tl) X 100%;交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。
全文摘要
本发明公开了制备抗汞离子的单克隆抗体及建立测定食品和环境中汞离子含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是选择了一种新的配体即6-巯基烟酸(MNA)，利用其上的羧基将配体与载体蛋白连接，再利用其上的巯基与氯化甲基汞相连，生成的CH3Hg-MNA-载体蛋白用作免疫原及包被抗原；运用杂交瘤抗体制备技术，制备出抗汞离子的单克隆抗体，建立了测定汞离子的间接竞争酶联免疫分析法，并用于食品和环境样品中汞离子的检测。
文档编号G01N33/577GK102621317SQ20121004206
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月23日 优先权日2012年2月23日
发明者杨红, 王玉珍, 邓安平 申请人:苏州大学