专利名称：抗cd2蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可特异结合CD2蛋白的单克隆抗体，及其在检测CD2蛋白中的应用。
背景技术：
⑶2也称为LFA-2、LEU-5或绵羊红细胞受体，分子量为45_58kD的单体分子，属免疫球蛋白超家族成员，可存在于成熟T细胞及胸腺细胞膜表面，也可表达于NK细胞。CD2分子是细胞间的粘附分子，也是信号传导分子。免疫组化实验下表达情况为(1)所有T淋巴细胞和NK细胞可表达，B淋巴细胞不表达；(2)正常骨髓细胞或正常肥大细胞不表达，但肥大细胞增生症的肥大细胞可表达。因此，CD2分子可作为一种广谱的T细胞标志物，用于正 常T细胞以及T细胞来源肿瘤的鉴别。在临床上，CD2蛋白可用于T细胞型急性淋巴细胞白血病(T-ALL)以及其它T细胞恶性肿瘤的辅助诊断。目前临床上通常通过免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中⑶2的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合CD2的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对CD2蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种结合特异性较高的抗CD2蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测CD2蛋白的免疫检测工具中的应用。为解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2012年5月16日，保藏编号为 CGMCC No. 6132。本发明还提供了一种特异性结合CD2蛋白的单克隆抗体9D1，由上述杂交瘤细胞
株产生。本发明所述单克隆抗体的制备方法如下(I)重组表达载体的构建根据⑶2基因的ORF全序列(如SEQ ID No. I所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和Mlul，并在其C末端引入Myc-DDK标签序列(如SEQ ID No. 2所示)，插入表达载体pCMV6_Entry，构建CD2重组表达质粒;(2)⑶2重组蛋白的表达与纯化以该质粒转染HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的⑶2重组蛋白；(3)单抗的筛选与制备采用上述纯化的⑶2重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CD2特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为9D1，亚型鉴定为IgGl ;制备小鼠腹水，通过亲和层析柱纯化⑶2单抗。分别通过Western Blot、免疫组化实验、免疫荧光验证该单抗的灵敏度和特异性。
上述单克隆抗体的特异性验证OriGene高密度蛋白芯片上包含10400个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。将本发明单克隆抗体9D1与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本发明单克隆抗体9D1特异性结合CD2蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。本发明还提供了单克隆抗体9D1在制备用于检测CD2蛋白的免疫检测工具中的应用。
具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体9D1 ;可检测组织细胞中⑶2的表达状况。本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于鉴别T细胞或T细胞来源肿瘤的试剂盒中的应用。CD2分子作为一种广谱的T细胞标志物，可用作T细胞的鉴定；另外，CD2分子同样可作为分辨T细胞来源肿瘤的生物标志物。临床上，检测CD2蛋白可用于T细胞型急性淋巴细胞白血病(T-ALL)以及其它T细胞恶性肿瘤的辅助诊断。所述T细胞来源的肿瘤为T细胞白血病或T细胞淋巴瘤，所述T细胞白血病为T细胞型急性淋巴细胞白血病(T-ALL)。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为抗人CD2单克隆抗体杂交瘤细胞株9D1 ；保藏单位全称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称CGMCC ；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期2012年5月16日；保藏编号CGMCCNo. 6132。
图I为Western blot验证CD2重组质粒在HEK293T细胞中的表达；左边泳道的上样样品为转染空载体的HEK293T细胞裂解液，右边泳道的上样样品为转染重组质粒PCMV6-⑶2的HEK293T细胞裂解液，杂交所用一抗为DDK标签抗体；图2为单克隆抗体9D1在9种不同细胞系中的Western blot结果；图3为免疫组化检测淋巴瘤组织的CD2表达(以9D1单抗为一抗)。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例I抗⑶2单克隆抗体的制备
一、⑶2重组表达质粒的构建以从ATCC获得的质粒BC033583 (含SEQ ID No. I所示CD20RF序列)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI、MluI，以及C末端Myc-DDK标签(序列如SEQ ID No. 2所示)，并克隆入表达载体pCMV6-Entry,构建CD2重组表达质粒。二、⑶2重组蛋白的表达与纯化I、转染 HEK293T 细胞HEK293T细胞以I : 3传至直径IOcm的细胞培养皿中继续培养；取7. 5mlDMEM(无血清及抗生素)培养基至50ml管中，加入300 μ IPEI MegaTranl. O混匀，然后加入75 μ g上述⑶2重组质粒DNA，混匀并静置30分钟；分别取515 μ I上述混合液至上述各细胞培养皿中于37°C、5%C02培养箱中培养。转染24小时后，每培养皿细胞添加25μ 12M 丁酸钠至终浓度5mM。
2、裂解细胞转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入ImlPBS进行漂洗，吸去PBS。加入Iml裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4°C离心，收集上清。3、DDK亲和层析柱纯化以孔径O. 45 μ m,直径33mm的PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管中，加入混合好的S印harose Beadslml，封口后放入360度混匀器中，于4°C结合2小时；取出15ml管，将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测，见图I (图I显示⑶2重组质粒在HEK293T细胞中正常表达)；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads3次，滴尽后用O. IM Glycine (pH3. 5)洗脱，第一次200 μ I,滴尽不收集，第二、三次各500 μ 1，第四次250 μ 1，收集至一个1.5mlTube中，并迅速加入NaH2PO4 CpH=Il. O)中和至pH7. O左右，每管加入甘油至终浓度为10%，Tween-80至终浓度为O. 1%。三、单抗的筛选与制备I、动物免疫上述纯化的⑶2重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50 μ g/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50 μ g/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。2、细胞融合骨髓瘤细胞采用BALB/c小鼠来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1: 10混合，滴加37°C的50%PEG (PH8. 0)lml，加入不完全培养基及其终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50ml，分装到3. 5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37°C、5% CO2恒温培养箱中进行培养。3、筛选和克隆融合7-10天内挑选细胞克隆，使用上述纯化的⑶2重组蛋白进行ELISA测试，标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取0D280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性；挑取阳性值高的单克隆定株，其对应融合板细胞株为9D1。4、腹水单抗的制备与纯化10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射O. 5ml降植烷，一周后每只小鼠用Iml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为
5X IO6/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，单抗9D1亚型为IgGl,采用proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在_20°C。以单抗 9D1 为一抗，对 H印G2、HeLa、HT29、A549、C0S7、Jurkat、MDCK、PCl2、MCF7九种细胞系的蛋白裂解液进行杂交、显色，其结果如图2所示，由图2可见CD2蛋白仅在Jurkat细胞系中有表达。实施例2以单抗9D1为一抗对淋巴瘤组织进行免疫组化检测I、取淋巴瘤组织进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为
6μ m ；2、脱錯与水化分析纯二甲苯3次X IOmin,无水乙醇3次X IOmin, 95 %乙醇 5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，去离子水浸泡3minX 3次；3、加入抗原修复液(O. 01M, pH6. O枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复2min，待高压锅温度降至约90°C时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3minX 3 次。4、使用3%过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶,室温静置lOmin。去离子水浸泡5minX 3 次。5、加上封闭液(PBS+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清)，37°C孵育60min。6、去除封闭液，勿冲洗，加入I 150比例稀释的本发明单抗9D1 ;置于湿盒中，37 0C 孵育 60min。PBST(含 O. l%Tween-20 )洗涤 2 次，每次洗涤 5min。PBST(含 O. 02%Tween-20 )洗漆I次，每次洗漆5min。7、滴加 Polink-试剂盒 2 (Catlog No. D37-15)中的试剂 1，37°C孵育 10-20 分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Pol ink-2试剂盒(Catlog No. D37-15)中的试剂2，37°C孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3 lOmin。蒸馏水洗涤。9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1%盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置lmin。10、脱水和透明75%乙醇5min, 100%乙醇5minX3次，85%乙醇5min,95%乙醇5min, 100%乙醇3X5min ;二甲苯3X5min，中性树胶封片。11、镜检，见图3。由图3可见淋巴瘤组织可见大量棕黄色颗粒，为⑶2蛋白表达阳性细胞，可将该淋巴瘤组织鉴定为T细胞来源的淋巴瘤。实施例3、0riGene蛋白芯片检测单克隆抗体9D1的特异性OriGene高密度蛋白芯片上包含10400个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片对9D1单克隆抗体进行特异性鉴定的具体步骤
I、将一张蛋白芯片放在50ml离心管中，使用40ml去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟；弃掉去离子水，使用IOmlPBST平衡芯片，室温处理10分钟。2、向50ml离心管中加入40ml5%脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。3、使用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释一抗9D1，稀释比例I : 200。4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300 μ I稀释一抗在封口膜上。5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4°C环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。
6、第二天将芯片移至50ml离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mlPBST (O. l%Tween_20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。7、使用封闭液(5% 脱脂牛奶)稀释二抗 DyLight649_conjugated AffiniPureFragment Goat-anti-Mouse IgG,稀释比例为 I : 400。8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育I小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。12、使用芯片扫描仪读取突光信号。13、根据BSA_Cy3以及BSA_Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number),蛋白ID,蛋白大小等信息。芯片杂交结果显示蛋白芯片上仅出现I个阳性信号点，对应蛋白为CD2 ;表明，本发明单克隆抗体9D1仅特异性结合CD2蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种特异性结合CD2蛋白的单克隆抗体9D1，由保藏编号为CGMCC No. 6132的杂交瘤细胞株产生。
2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 6132。
3.如权利要求I所述的单克隆抗体在制备用于检测CD2蛋白的免疫检测工具中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
5.一种免疫组化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求I所述的单克隆抗体。
6.如权利要求I所述的单克隆抗体在制备用于鉴别T细胞或T细胞来源肿瘤的试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述T细胞来源肿瘤为T细胞白血病或T细胞淋巴瘤。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述T细胞白血病为T细胞型急性淋巴细胞白血病。
全文摘要
本发明公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCCNo.6132)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体9D1。本发明还涉及单克隆抗体9D1在制备用于检测CD2蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体9D1的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体9D1在制备用于鉴别T细胞或T细胞来源肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与CD2蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了CD2蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
文档编号G01N33/68GK102827281SQ201210274519
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者何为无, 马东辉, 袁克湖, 陈坚, 兰住声, 方丽, 汪芳迅, 管宝全 申请人:无锡傲锐东源生物科技有限公司