糟醅中黄曲霉毒素b1的提取及检测方法
【专利摘要】本发明涉及糟醅中黄曲霉毒素B1的提取方法，属于分析检测领域。本发明提供一种糟醅中黄曲霉毒素B1的提取方法，包括如下步骤：称取烘干的糟醅，过筛，加入甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮超声波震荡后过滤，取滤液备用，用二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮萃取滤液，收集二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮层并烘干即可。本方法可以快速准确的从糟醅中提取出黄曲霉毒素B1，然后利用酶联免疫法对提取出的黄曲霉毒素B1进行检测。本发明的提取和检测方法能够很好地应用于糟醅中黄曲霉毒素B1的提取与检测，为其研究提供了一条更好的途径。
【专利说明】糟醅中黄曲霉毒素BI的提取及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析检测领域，具体涉及糟醅中黄曲霉毒素BI的提取及检测方法。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素(Af latoxin，AFT)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒的次生代谢产物，它广泛存在于农作物及食物中，黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。
[0003]白酒酿造主要是以粮食为原料，从而存在着被黄曲霉毒素BI污染的可能性，所以在白酒的酿造过程中做好对黄曲霉毒素BI的检测尤为重要。现阶段有关黄曲霉毒素BI的检测主要集中在粮食和食品上，而白酒酿造过程中的酒糟是一种比较复杂的物质，现有的检测方法并不能完全适应酒糟中黄曲霉毒素BI的检测，所以建立一套准确、成本低、操作简便、快速且适应白酒生产过程的毒素检测方法，运用于白酒酿造过程中黄曲霉毒素BI检测，意义重大。
[0004]本方法可以快速准确的从糟醅中提取出黄曲霉毒素BI然后利用酶联免疫法(ELISA)对提取出的黄曲霉毒素BI进行检测。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种糟醅中黄曲霉毒素BI的提取方法，该方法快速、准确、易操作。
[0006]糟醅中黄曲霉毒素BI的提取方法，包括以下步骤:
[0007]a、预处理:称取烘干的糟醅，过筛，在筛下物中加入溶剂A，超声震荡，过滤，滤液备用；其中，所述的溶剂A为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种；
[0008]b、萃取:用溶剂B萃取滤液，收集溶剂B相层，烘干后即得到黄曲霉毒素BI ;其中所述的溶剂B为二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中任意一种。
[0009]具体的，上述提取方法步骤a中所述的过筛为过20目筛。
[0010]优选的，上述提取方法步骤a中所述的溶剂A为甲醇水溶液。
[0011]优选的，上述提取方法步骤a中所述的甲醇水溶液体积浓度为45~85%。
[0012]进一步优选的，上述提取方法步骤a中所述的甲醇水溶液体积浓度为65%。
[0013]具体的，上述提取方法步骤a中糟醅与溶剂A的固液比为Ig: 7~10ml。
[0014]优选的，上述提取方法步骤a中糟醅与溶剂A的固液比为Ig: 10ml。
[0015]具体的，上述提取方法步骤a中超声震荡功率为120~200W。
[0016]优选的，上述提取方法步骤a中超声震荡功率为180W。
[0017]具体的，上述提取方法步骤a中超声震荡时间为10~40min。
[0018]优选的，上述提取方法步骤a中超声震荡时间为30min。
[0019]优选的，上述提取方法步骤b中所述的溶剂B为二氯甲烷。
[0020]最优选的，上述提取方法中所述溶剂A为体积浓度65%的甲醇水溶液，超声震荡功率为180W，超声震荡时间为30min，所述溶剂B为二氯甲烷。
[0021]本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种黄曲霉毒素BI的检测方法。该方法包括以下步骤:
[0022]①、通过上述的提取方法提取出黄曲霉毒素BI ；
[0023]②、在所得黄曲霉毒素BI中加入溶剂C，采用酶联免疫法检测黄曲霉毒素BI的含量；其中所述的溶剂C为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种。
[0024]优选的，上述检测方法步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为40~80%。
[0025]进一步优选的，上述检测方法步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为50%。
[0026]优选的，上述检测方法步骤②中溶剂C的加入量为IOg糟醅对应加入5~15ml。[0027]更优选的，上述方法步骤②中溶剂C的加入量为IOg糟醅对应加入10ml。
[0028]本方法利用了超声波提取糟醅中黄曲霉毒素BI，不仅快速、准确、易操作，而且取得的效果比国标方法要好得多，从而使本方法能很好地适应白酒的生产过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1不同震荡方式的比较效果
[0030]图2甲醇水溶液浓度对提取结果的影响
[0031]图3提取温度对提取结果的影响
[0032]图4提取时间对提取结果的影响
[0033]图5超声波功率对提取结果的影响
【具体实施方式】
[0034]一种糟醅中黄曲霉毒素BI的提取方法，包括以下步骤:
[0035]a、预处理:称取烘干的糟醅，过筛，在筛下物中加入溶剂A，超声震荡，过滤，滤液备用；其中，所述的溶剂A为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种；
[0036]b、萃取:用溶剂B萃取滤液，收集溶剂B相层，烘干后即得到黄曲霉毒素BI ;其中所述的溶剂B为二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中任意一种。
[0037]具体的，上述提取方法步骤a中所述的过筛为过20目筛。
[0038]优选的，上述提取方法步骤a中所述的溶剂A为甲醇水溶液。
[0039]优选的，上述提取方法步骤a中所述的甲醇水溶液体积浓度为45~85%。
[0040]进一步优选的，上述提取方法步骤a中所述的甲醇水溶液体积浓度为65%。
[0041]具体的，上述提取方法步骤a中糟醅与溶剂A的固液比为Ig: 7~10ml。
[0042]优选的，上述提取方法步骤a中糟醅与溶剂A的固液比为Ig: 10ml。
[0043]具体的，上述提取方法步骤a中超声震荡功率为120~200W。
[0044]优选的，上述提取方法步骤a中超声震荡功率为180W。
[0045]具体的，上述提取方法步骤a中超声震荡时间为10~40min。
[0046]优选的，上述提取方法步骤a中超声震荡时间为15min。
[0047]优选的，上述提取方法步骤b中所述的溶剂B为二氯甲烷。
[0048]最优选的，上述提取方法所述溶剂A为体积浓度65%的甲醇水溶液，超声震荡功率为180W，超声震荡时间为30min，所述溶剂B为二氯甲烷。[0049]一种黄曲霉毒素BI的检测方法，包括以下步骤:
[0050]①通过上述的提取方法提取出黄曲霉毒素BI ；
[0051]②在所得黄曲霉毒素BI中加入溶剂C，采用酶联免疫法检测黄曲霉毒素BI的含量；其中所述的溶剂C为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种。
[0052]优选的，上述检测方法步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为40~80%。
[0053]进一步优选的，上述检测方法步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为50%。
[0054]优选的，上述检测方法步骤②中溶剂C的加入量为原料IOg糟醅对应加入5~15ml ο
[0055]更优选的，上述方法步骤②中溶剂C的加入量为原料IOg糟醅对应加入10ml。
[0056]由于糟醅中混杂着酸、醇等复杂物质，与普通粮食的成分及含量不同，单纯的国标法只适用于粮食作物，却不完全适用于检测糟醅中的黄曲霉毒素BI。本发明的发明人针对糟醅的特殊成分，做了大量尝试和探索发现，采用甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮作为提取溶剂，配合超声震荡，可以很好地适用于提取糟醅中黄曲霉毒素BI，优选采用甲醇水溶液，效果较好同时无毒。 [0057]本发明技术方案的提出是基于以下原理:从糟醅中提取黄曲霉毒素BI主要基于液液萃取的原理，即使用一定浓度的甲醇溶液浸取糟醅中的黄曲霉毒素BI，由于黄曲霉毒素BI在二氯甲烷中溶解度大于甲醇溶液，故再使用二氯甲烷对黄曲霉毒素BI进行萃取，重复一次，以确保充分萃取；再者黄曲霉毒素BI的沸点要远高于二氯甲烷，对萃取后的二氯甲烷相进行水浴烘干，则可以除去一些低沸点的杂质，最后用一定浓度的甲醇溶液溶解烘干后的物质，即为待测样。
[0058]试验例I震荡方式的选择
[0059]糟醅烘干粉碎后，过20目筛，分别准确称取IOg样品于三只250mL锥形瓶中，编号
①、②、③，分别加入IOOmL提取液，①号锥形瓶室温超声提取30min，②号锥形瓶室温漩涡振荡30min,③号锥形瓶室温超声镟润交替进行30min,用快速定性滤纸过滤于锥形瓶中，吸取IOmL滤液于分液漏斗中，加入40mL 二氯甲烷，加塞振摇5min，静置分层(约30min)，放出下层相，再加入IOmL 二氯甲烷于分液漏斗中，重复提取，合并二氯甲烷相，经盛有约20g预先用二氯甲烷润湿的无水Na2SO4滤纸漏斗过滤于锥形瓶中，65°C水浴烘干，冷却后加入IOmL甲醇-水(I: 1)，即为待测样品，用酶联免疫法测定，平行实验三次，确定最佳提取方式，实验结果见图1。
[0060]由图1可以看出采用超声波震荡提取黄曲霉毒素BI效果明显高于其它两种震荡方式。
[0061]试验例2单因素试验
[0062]取IOg烘干后的糟醅磨碎，过20目筛，选取提取液甲醇浓度、提取时间、超声波提取功率、提取温度四个因素进行单因素试验，单因素试验设计见表1。
[0063]表1单因素试验设计
【权利要求】
1.糟醅中黄曲霉毒素BI的提取方法，其特征在于:包括以下步骤: a、预处理:称取烘干的糟醅，过筛，在筛下物中加入溶剂A，超声震荡，过滤，滤液备用；其中，所述的溶剂A为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种； b、萃取:用溶剂B萃取滤液，收集溶剂B相层，烘干后即得到黄曲霉毒素BI;其中所述的溶剂B为二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中任意一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a中，所述的溶剂A为甲醇水溶液，甲醇水溶液体积浓度为45~85%，优选为65%。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于:步骤a中，糟醅与溶剂A的固液比为Ig: 7 ~IOmL,优选为 Ig: 10mL。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于:步骤a中，超声震荡功率为120~200W，优选为 180W。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于:步骤a中，超声震荡时间为10~40min,优选为 30min。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于:步骤b中，所述的溶剂B为二氯甲烷。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述溶剂A为体积浓度65%的甲醇水溶液，超声震荡功率为180W，超声震荡时间为30min，所述溶剂B为二氯甲烷。
8.一种黄曲霉毒素B I的检测方法，其特征在于:包括以下步骤: ①、根据权利要求1~7所述的提取方法提取出黄曲霉毒素BI； ②、在所得黄曲霉毒素BI中加入溶剂C，采用酶联免疫法检测黄曲霉毒素BI的含量；其中所述的溶剂C为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于:步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为40~80%，优选为50%。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于:步骤②中溶剂C的加入量为IOg糟醅对应加入5~15ml，优选为10ml。
【文档编号】G01N33/53GK103896959SQ201410116242
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】胡竹行, 沈才洪, 敖宗华, 王松涛, 王明, 廖源, 周军 申请人:泸州品创科技有限公司