技术领域本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测药品、生物样品中的塞替派技术。
背景技术：
塞替派（Thiotepa，TEPA）分子式为：C6H12N3PS，也称为息安的宾、三胺硫磷、三乙烯硫代磷酰胺。本品为20世纪50年代初期合成的抗肿瘤药，是乙烯亚胺类烷化剂的代表。其作用原理类似氮芥，在体内产生活性烷化基团乙烯亚胺基具有较强的细胞毒作用。乙烯亚胺基能和参与细胞DNA组成的核碱基，如鸟嘌呤结合，改变DNA的功能，影响肿瘤细胞分裂。实验研究证明，本品对多种动物肿瘤均有明显的抑制作用，抑制核酸的合成；在组织培养中，可抑制动物胚胎细胞、人体细胞及肿瘤细胞的有丝分裂。近年来的表明，本品对垂体促滤泡激素含量有影响，腹腔注射可使卵巢滤泡萎缩，并可影响睾丸功能。属乙撑亚胺类烷化剂，因其有3个功能基团，可与DNA形成交叉联结，改变DNA的功能，影响癌细胞的分裂。临床用于乳腺癌、卵巢癌，也可用于肺癌、宫颈癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、喉癌等。目前检测塞替派方法是酸碱滴定法，这种方法是经典的化学法，对常量测定准确度比较高，但选择性比较差，而且这种方法对微量的塞替派无法检测。因此，建立一种选择性好、灵敏度高、操作简便，用于检测塞替派的方法，对临床检测、药理研究、质量监控都具有十分重要的意义。分子印迹技术是制备具有特定选择性和亲和能力的分子识别材料的新兴技术，并以其预定性、特异识别性和广泛实用性三大显著特点在色谱分离、固相萃取、仿生传感、膜分离等诸多领域显示出良好的发展与应用前景。当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注。依据此技术制备的分子印迹电化学传感器，应用于药物分析、生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高而且再生和可逆性差，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、政府管理部门等的迫切需要的，对药品、生物样品中的塞替派含量准确定量测定十分必要，对于塞替派生产和药理研究也具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法，主要是以塞替派为模板，在玻碳电极表面通过乙烯基三乙氧基硅烷、纳米金粒子的修饰，提高了传感器的灵敏度，采用滴涂法制备塞替派分子印迹电化学传感器。仪器与试剂CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），玻碳电极（GCE）为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器；乙烯基三乙氧基硅烷，无水乙醇，硫酸，二亚乙基三胺，丙烯酸-1，2，3-三羧酸，马来酸酐，过流酸钾，塞替派；氯金酸，柠檬酸钠，磷酸缓冲溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。本发明的目的通过如下技术方案实现。一种塞替派分子印迹电化学传感器制备方法，其特征在于,该方法具有以下工艺步骤：（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Al2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为25~30%的乙烯基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至55±2℃浸泡150~180min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，在放入9mol/L硫酸中浸泡20min，取出后，用水洗涤干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.30mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡3~5h，取出后用水洗涤，再放入质量百分浓度为15~20%的柠檬酸钠溶液中浸泡5h，取出后用水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）塞替派分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，水：66~74%，丙烯酸-1，2，3-三羧酸：6~14%，马来酸酐：6~14%，二亚乙基三胺：3~8%，过流酸钾：2.0~4.0%，塞替派：1.0~3.0%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通惰性气体除氧10min，惰性气体氛围，温度升至60±2℃搅拌反应4~6h，即得塞替派分子印迹聚合物溶胶；（4）塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法：取塞替派分子印迹聚合物溶胶12~15μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与醋酸的混合溶液浸泡4~6h，除去电极上的模板分子，用水洗涤，自然干燥，即得塞替派分子印迹电化学传感器。一种塞替派分子印迹电化学传感器制备方法中，所述的水为高纯水。一种塞替派分子印迹电化学传感器制备方法中，步骤（3）中所述的惰性气体氛围为通惰性气体一直通入直到反应结束。一种塞替派分子印迹电化学传感器制备方法中，步骤（3）中所述的惰性气体为氖气或氩气。一种塞替派分子印迹电化学传感器制备方法中，步骤（4）中所述的乙醇与盐酸混合溶液的体积比为10~12：1。本发明的优点及效果是：本发明将印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，玻碳电极通过硅烷偶联剂连接将纳米金修饰在电极表面，使其提高导电性能，再在纳米金的基础上滴涂分子印迹聚合物，成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器。通过与无纳米金修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本发明制备的塞替派分子印迹电化学传感器的响应信号大大提高。该印迹传感器对塞替派表现出较高的亲和性、灵敏性和选择性，响应电流与塞替派的浓度在1.0×10-8~2.12×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为6.18×10-9mol/L将本发明制备的塞替派分子印迹电化学传感器成功用于药品、生物样品中塞替派的检测中，回收率在94.82~104.37%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药检测等相关领域。具体实施方式实施例1（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Al2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为28%的乙烯基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至55±2℃浸泡170min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，在放入9mol/L硫酸中浸泡20min，取出后，用水洗涤干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.30mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡4h，取出后用水洗涤，再放入质量百分浓度为18%的柠檬酸钠溶液中浸泡5h，取出后用水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）塞替派分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，水：70mL，丙烯酸-1，2，3-三羧酸：10g，马来酸酐：10g，二亚乙基三胺：5g，过流酸钾：3g，塞替派：2.0g，搅拌溶解，通惰性气体除氧10min，惰性气体氛围，温度升至60±2℃搅拌反应5h，即得塞替派分子印迹聚合物溶胶；（4）塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法：取塞替派分子印迹聚合物溶胶13μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与醋酸的混合溶液浸泡5h，除去电极上的模板分子，用水洗涤，自然干燥，即得塞替派分子印迹电化学传感器。实施例2（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Al2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为30%的乙烯基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至55±2℃浸泡150min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，在放入9mol/L硫酸中浸泡20min，取出后，用水洗涤干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.30mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡3h，取出后用水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的柠檬酸钠溶液中浸泡5h，取出后用水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）塞替派分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，水：74mL，丙烯酸-1，2，3-三羧酸：6g，马来酸酐：6g，二亚乙基三胺：7g，过流酸钾：4g，塞替派：3.0g，搅拌溶解，通惰性气体除氧10min，惰性气体氛围，温度升至60±2℃搅拌反应4h，即得塞替派分子印迹聚合物溶胶；（4）塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法：取塞替派分子印迹聚合物溶胶14μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与醋酸的混合溶液浸泡6h，除去电极上的模板分子，用水洗涤，自然干燥，即得塞替派分子印迹电化学传感器。实施例3（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Al2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为25%的乙烯基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至55±2℃浸泡180min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，在放入9mol/L硫酸中浸泡20min，取出后，用水洗涤干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.30mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡5h，取出后用水洗涤，再放入质量百分浓度为15%的柠檬酸钠溶液中浸泡5h，取出后用水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）塞替派分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，水：66mL，丙烯酸-1，2，3-三羧酸：13g，马来酸酐：12g，二亚乙基三胺：6g，过流酸钾：2g，塞替派：1.0g，搅拌溶解，通惰性气体除氧10min，惰性气体氛围，温度升至60±2℃搅拌反应6h，即得塞替派分子印迹聚合物溶胶；（4）塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法：取塞替派分子印迹聚合物溶胶15μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与醋酸的混合溶液浸泡5.5h，除去电极上的模板分子，用水洗涤，自然干燥，即得塞替派分子印迹电化学传感器。实施例4（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Al2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为26%的乙烯基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至55±2℃浸泡160min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，在放入9mol/L硫酸中浸泡20min，取出后，用水洗涤干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.30mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡4.5h，取出后用水洗涤，再放入质量百分浓度为16%的柠檬酸钠溶液中浸泡5h，取出后用水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）塞替派分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，水：68mL，丙烯酸-1，2，3-三羧酸：7g，马来酸酐：14g，二亚乙基三胺：8g，过流酸钾：2g，塞替派：1.0g，搅拌溶解，通惰性气体除氧10min，惰性气体氛围，温度升至60±2℃搅拌反应4.5h，即得塞替派分子印迹聚合物溶胶；（4）塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法：取塞替派分子印迹聚合物溶胶12μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与醋酸的混合溶液浸泡4.5h，除去电极上的模板分子，用水洗涤，自然干燥，即得塞替派分子印迹电化学传感器。实施例5（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Al2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为27%的乙烯基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至55±2℃浸泡170min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，在放入9mol/L硫酸中浸泡20min，取出后，用水洗涤干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.30mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡3.5h，取出后用水洗涤，再放入质量百分浓度为19%的柠檬酸钠溶液中浸泡5h，取出后用水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）塞替派分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，水：72mL，丙烯酸-1，2，3-三羧酸：11g，马来酸酐：7g，二亚乙基三胺：5g，过流酸钾：3g，塞替派：2.0g，搅拌溶解，通惰性气体除氧10min，惰性气体氛围，温度升至60±2℃搅拌反应5.5h，即得塞替派分子印迹聚合物溶胶；（4）塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法：取塞替派分子印迹聚合物溶胶13μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与醋酸的混合溶液浸泡4h，除去电极上的模板分子，用水洗涤，自然干燥，即得塞替派分子印迹电化学传感器。实施例6将上述实施例1~5所制备的塞替派分子印迹电化学传感器，用于塞替派的检测，步骤如下：（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的塞替派标准溶液，底液为pH6.8的磷酸盐缓冲溶液；（2）工作曲线绘制：将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明所述一种塞替派分子印迹电化学传感器的制备方法所制备的塞替派分子印迹电化学传感器为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，在K3[Fe(CN)6]溶液中，采用循环伏安法在0.10~1.2V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I0，含有不同浓度的塞替派标准溶液的响应电流即为Ii，响应电流降低的差值为△I=I0-Ii，△I与塞替派标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△I~c工作曲线；（3）塞替派的检测：用待测样品代替步骤（1）中的塞替派标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中塞替派的含量；所述K3[Fe(CN)6]溶液的浓度为6.0mmol/L；所述pH6.8的磷酸盐缓冲溶液的浓度在100mmol/L。响应电流与塞替派的浓度在1.0×10-8~2.12×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为6.18×10-9mol/L将本发明制备的塞替派分子印迹电化学传感器成功用于药品、生物样品中塞替派的检测中，回收率在94.82~104.37%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药检测等相关领域。