基于金纳米团簇荧光特性的多聚磷酸盐检测新方法与流程

本发明涉及一种以牛血清蛋白(BSA)为模板，采用化学还原方法合成直径为2nm的牛血清蛋白-金纳米团簇(BSA-AuNCs)，并由BSA-AuNCs合成得到BSA-AuNCs-Cu²⁺荧光传感器，以及利用该BSA-AuNCs-Cu²⁺荧光传感器对多聚磷酸盐含量进行检测的方法。

背景技术：

多聚磷酸盐作为保水剂和品质改良剂，被广泛应用于水产品的保存和运输过程中，起到保持水分、减少液滴流失、改善口感的作用，同时还可以调节pH值、乳化、缓冲、螯合金属离子等。然而，在水产品加工过程中过多地使用多聚磷酸盐，不仅危害了消费者的权益，更是对广大消费者的健康造成影响。

摄入过量的多聚磷酸盐，会促进血液凝结，其降解产物磷酸盐也可能增大摄入者心脑血管疾病发生的可能性；多磷酸盐的过量残留，也会影响人体中钙、铁、铜、锌等必需元素的吸收平衡，体内的多聚磷酸盐不断累积会导致机体钙磷的失衡，影响钙的吸收，容易导致骨质疏松症。

随着我国加入世界贸易组织，水产品的出口需求量日益增多，很多国内出口企业为提高出成率、保持水产品品质、提高经济效益而出现了在水产品中过量添加多聚磷酸盐的情况，超出欧盟以及国际食品法典(CODEX)规定最大限量，被频频通报多聚磷酸盐超标，因而形成贸易壁垒，严重影响我国出口企业的经济利益。食品法典(CODEX)允许多聚磷酸盐在冷冻水产制品(鱼片、虾等)和终产品中最大浓度为1％，而欧盟法规允许最大用量为5g/kg，巴西和加拿大等国食品局规定在不同最终产品中最大浓度为0.1％或0.5％。因此，检测水产品中的多聚磷酸盐含量，显得十分重要。

目前对于多聚磷酸盐的检测方法主要有薄层层析色谱法、高效毛细管电泳法、离子色谱法及核磁共振法等，其中薄层层析色谱法操作方便、设备简单、显色容易，同时展开速率快，但灵敏度低，不能准确定量且繁琐耗时，不能满足现代检测需求；高效毛细管电泳法及核磁共振法均因操作过程繁琐、对检测人员要求较高以及食品基体较复杂等原因，不能广泛地应用到食品分析当中；离子色谱法是常见的检测水产品中多聚磷酸盐含量的方法，具有分析效率高、速度快，检测灵敏度高的优点，但定性能力较差。

近年来，纳米技术发展迅速。荧光金纳米团簇(gold nanocluster，Au NCs)所展现出的尺寸小、水溶性好、低毒性、表面易于修饰、荧光稳定性强等优点，使其为生物分析及医学诊断研究提供了新的标记手段，开辟了新的应用领域。利用金纳米团簇的荧光猝灭原理设计的荧光探针能特异性地检测环境中的化学和生物制剂等。2009年，Xie等利用牛血清蛋白BSA作为模板合成了具有红色荧光的BSA-AuNCs，加入Cu²⁺可以使BSA-AuNCs的荧光淬灭，而加入金属螯合剂则可使荧光恢复。由此推测，加入金属螯合剂多聚磷酸钠PPy能使BSA-AuNCs-Cu²⁺的荧光恢复。本发明以BSA为模板，采用化学还原的方法制备直径2nm的荧光生物传感器BSA-AuNCs，通过确定最优检测，探索BSA-AuNCs-Cu²⁺对PPy的检测机制。

技术实现要素：

本发明以牛血清蛋白(BSA)为模板，采用化学还原方法合成直径为2nm的牛血清蛋白-金纳米团簇(BSA-AuNCs)，能在波长范围为200nm-800nm紫外光的扫描下发出红色的荧光。当Cu²⁺与BSA链中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs-Cu²⁺时，荧光会猝灭；当加入多聚磷酸根(PPy)时，PPy将与Cu²⁺螯合使Cu²⁺从BSA-AuNCs-Cu²⁺表面脱离出来，形成BSA-AuNCs，荧光恢复。基于这样的原理，发明者设计出BSA-AuNCs-Cu²⁺荧光传感器，对多聚磷酸盐含量进行检测。这个荧光传感器具有无污染、简单、快速、高选择性的特点，线性范围为10-100nM，检出限为10nM。实验结果表明，PPy浓度越大，相应的，系统的荧光恢复得更多，且PPy的浓度与系统的荧光恢复率呈现良好的线性关系。

一方面，本发明涉及一种以牛血清蛋白(BSA)为模板，采用化学还原方法合成直径为2nm的牛血清蛋白-金纳米团簇(BSA-AuNCs)。

另一方面，本发明涉及该牛血清蛋白-金纳米团簇(BSA-AuNCs)的制备方法，所述方法包括在37℃下将HAuCl₄溶液加入到BSA溶液中，剧烈搅拌后，加入NaOH溶液调节pH值至12，将该混合液在37℃下水浴12h。更具体地，HAuCl₄溶液的浓度为1.0M，BSA溶液的浓度为50mg/mL，NaOH溶液的浓度为1.0M。

另一方面，本发明涉及BSA-AuNCs-Cu²⁺荧光传感器，其包含BSA-AuNCs溶液、pH为6的NaAc-HAc缓冲液、Cu²⁺溶液。具体地，所述Cu²⁺溶液的浓度为10μM。

另一方面，本发明涉及BSA-AuNCs-Cu²⁺荧光传感器在测定多聚磷酸盐含量中的用途。

本发明通过研究以BSA为模板，采用化学还原的方法成功制备了直径2nm的荧光生物传感器BSA-AuNCs，用以检测PPy的含量。结果表明，金纳米团簇在BSA的作用下形成BSA-AuNCs，具有红色的荧光。加入Cu²⁺时，Cu²⁺与BSA链中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs-Cu²⁺，致使荧光淬灭。接着加入金属螯合剂PPy，PPy具有更高的与Cu²⁺螯合的能力，与Cu²⁺螯合而使Cu²⁺从BSA-AuNCs表面脱离出来，使系统荧光恢复，且随着加入的多聚磷酸根离子浓度的增大，相应的，系统的荧光恢复得也越多。基于这样的原理，本发明设计了一种BSA-AuNCs荧光生物传感器，用于检测水产品中PPy的含量。此方法线性范围为10nM-100nM，检出限为10nM。因此，本发明检测方法具有工艺流程简单，操作方便，检测PPy灵敏度高、高效、快速，具有实用性等优点。

附图说明

图1(a)示出了BSA-AuNCs溶液的紫外光谱图。

图1(b)示出了平均大小为2nm的BSA-AuNCs的电镜图(低倍数)。

图1(c)示出了Cu²⁺与BSA-AuNCs发生化学反应，形成BSA-AuNCs-Cu²⁺的电镜图(高倍数)。

图2示出了荧光生物传感器BSA-AuNCs的设计程序与检测机制图解。

图3(a)示出了BSA-AuNCs的荧光光谱图。

图3(b)示出了EDTA的荧光光谱图。

图4示出了不同浓度Cu²⁺的荧光光谱图。

图5示出了反应时间与系统荧光值的关系。

图6(a)和(b)示出了BSA-AuNCs荧光生物传感器检测PPy的含量。

具体实施方式

下面，将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本发明以牛血清蛋白(BSA)为模板，采用化学还原方法合成直径为2nm的牛血清蛋白-金纳米团簇(BSA-AuNCs)，能在波长范围为200nm-800nm紫外光的扫描下发出红色的荧光。当Cu²⁺与BSA链中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs-Cu²⁺时，荧光会猝灭；当加入多聚磷酸根(PPy)时，PPy将与Cu²⁺螯合使Cu²⁺从BSA-AuNCs-Cu²⁺表面脱离出来，形成BSA-AuNCs，荧光恢复。基于这样的原理，发明者设计出BSA-AuNCs-Cu²⁺荧光传感器，对多聚磷酸盐含量进行检测。这个荧光传感器具有无污染、简单、快速、高选择性的特点，线性范围为10-100nM，检出限为10nM。结果表明，PPy浓度越大，相应的，系统的荧光恢复得更多，且PPy的浓度与系统的荧光恢复率呈现良好的线性关系。

1.试剂与仪器

表1：实验试剂

表2：实验仪器

注：所有的化学物质纯度应超过99％，并且没有进一步地净化。每一个步骤所用的水应为超纯水。

2.BSA-AuNCs的制备

在37℃下，将15mL 10.0mM的HAuCl₄溶液加入15mL、50mg/mL BSA溶液中，剧烈搅拌。2min后，加入1.3mL、1.0M的NaOH调节pH值至12，该混合液在37℃下水浴12h。溶液的颜色将从浅黄色变为浅棕色，然后变成深棕色。最后，BSA-AuNCs溶液得以制成，用超纯水稀释到200mL，并在4℃下保存以备用。

3.多聚磷酸盐离子的检测方法

将1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH为6的NaAc-HAc缓冲液、10μM Cu²⁺溶液以及1.00mL不同浓度的多聚磷酸盐(PPy)加入10mL的比色管中，用超纯水稀释到10mL并快速混匀，静置20min，使用荧光分度计测其荧光值。同时做试剂空白试验。

△F＝F₁-F₀……………………………………………(1)

式中：

△F—系统的相对荧光强度；

F1—溶液的荧光强度；

F0—空白溶液的荧光强度

荧光猝灭率＝△F/F₀……………………………………(2)

式中：

△F—系统的相对荧光强度；

F0—空白溶液的荧光强度

4.结果和讨论

4.1BSA-AuNCs的紫外光谱分析

取上述配制好的BSA-AuNCs溶液，使用紫外分光光度计进行扫描，扫描波长范围为200nm-800nm，得出紫外光谱图如图1(a)所示，其中，横坐标表示扫描波长，纵坐标表示相应的吸光度。从图中可看出，在200nm-800nm的波长范围内，BSA-AuNCs没有吸收峰，而是一条平滑向下延伸的曲线。对此进行分析，出现这种情况的原因是，所合成的金纳米团簇尺寸很小，不会产生大尺寸金纳米颗粒的特征吸收峰，因而在200nm-800nm的波长范围内是没有吸收峰的。

图1(b)展现了电镜下平均大小为2nm的BSA-AuNCs，它们呈球形，具有较好的分散性。当Cu²⁺加入到BSA-AuNCs系统时，Cu²⁺与BSA-AuNCs发生化学反应，形成BSA-AuNCs-Cu²⁺(如图1(c))所示，而体积也相应地变大，荧光发生猝灭。当往BSA-AuNCs-Cu²⁺中加入PPy时，BSA-AuNCs的尺寸大小便会恢复到大约2nm，这是因为PPy与Cu²⁺发生螯合，Cu²⁺从BSA-AuNCs-Cu²⁺中移除而使BSA-AuNCs的体积减小到原来的大小，同时荧光特性恢复。上述检测机制很好地说明了，从BSA-AuNCs、BSA-AuNCs-Cu²⁺到BSA-AuNCs-Cu²⁺-PPy，它们的颗粒大小发生变化，相应地，其荧光特性也发生变化。

4.2BSA–AuNCs荧光生物传感器物检测多聚磷酸根离子的机制

利用蛋白质-牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)作为模板原位合成BSA-Au NCs，该团簇材料由25个金原子组成，具有红色荧光(λem＝640nm)，荧光量子产率(QY)为6％。游离态Cu²⁺可与蛋白质中的巯基结合，干扰巯基的活性。Cu²⁺会与金纳米团簇表面的谷胱甘肽(glutathine，GSH)保护层发生配位作用(GSH:Cu²⁺＝2:1)，该作用引起Au NCs团聚从而导致荧光降低。值得注意的是，加入金属离子螯合剂后^[13]，被Cu²⁺抑制的荧光又可得到恢复。

上述荧光感应器的设计程序与检测机制的图解如图2所示。BSA-AuNCs与Cu²⁺结合成为BSA-AuNCs-Cu²⁺，导致BSA-AuNCs荧光性降低；在上述系统中加入金属螯合剂PPy，PPy与Cu²⁺螯合，使Cu²⁺从BSA-AuNCs表面释放出来，BSA-AuNCs荧光值得以恢复。

如图3(a)所示，一曲线表示将1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH为6的NaAc-HAc缓冲液、10μM Cu²⁺溶液混合并稀释至10mL，静置20min，使用荧光分度计测得的荧光光谱图，其中激发波长为400nm，扫描范围为560-660nm，最大吸收峰在618nm处；另一曲线表示将1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH为6的NaAc-HAc缓冲液、10μM Cu²⁺及100nM PPy溶液混合并稀释至10mL，静置20min，使用荧光分度计测得的荧光光谱图，其中激发波长为400nm，扫描范围为560-660nm，最大吸收峰在618nm处。由图3(a)明显可见，在BSA-AuNCs-Cu²⁺溶液中加入PPy后，荧光光谱曲线往上移动，即荧光值增大了。这是因为PPy具有更高的与Cu²⁺螯合的能力，当系统加入PPy时，Cu²⁺将从BSA-AuNCs表面脱离出来而使荧光恢复。根据BSA-AuNCs-Cu²⁺的这些特性，一个新型的检测PPy的荧光感应器就设计出来了。

基于上述BSA-AuNCs-Cu²⁺荧光生物传感器物的检测原理，我们发现：添加的金属螯合剂浓度越大，相应的，BSA-AuNCs-Cu²⁺溶液体系的荧光恢复得越大，且呈现一定的线性关系。根据上述发现，现进行验证试验：配制不同浓度的金属螯合剂EDTA，浓度分别为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM，分别加入1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL10μM Cu²⁺溶液及1.00mL pH为6的NaAc-HAc缓冲液，溶混合并稀释至10mL，静置20min，使用荧光分度计分别测其荧光值，所得数据进行处理，得出曲线图如图3(b)所示。从图中可以看出，随着EDTA浓度的增大，(F1-F0)/F0的值也随之增大。

4.3检测多聚磷酸根离子的最佳外界条件

为了避免检测过程中受其他外界因素的干扰，使多聚磷酸根离子浓度的检测结果更为准确，因此，必须保证多聚磷酸根离子浓度的检测是在最佳外界条件下进行的。为使实验更为顺利地进行，在探索检测多聚磷酸根离子浓度的最佳外界条件过程中，统一设定反应温度为室温(25℃)，采用单一变量法，主要研究了试剂数量及反应时间在灵敏性、选择性、准确性和重现性等方面的影响。

4.3.1BSA-AuNCs和Cu²⁺浓度的影响

为研究Cu²⁺浓度对系统荧光值的影响，现采用控制变量法，通过改变Cu²⁺的浓度，观察系统的荧光值变化情况，以探求检测体系荧光值中最佳的Cu²⁺浓度。

取1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM的Cu²⁺溶液，分别加入1.00mL BSA-AuNCs溶液及1.00mL pH为6的NaAc-HAc缓冲液，溶液混合并稀释至10mL，静置20min，使用荧光分度计分别测其荧光值，其中激发波长为400nm，扫描波长为500nm-700nm，最大吸收峰在618nm处。所得数据进行处理，得出曲线图如图4所示。由图4可知，随着Cu²⁺浓度的增大，相应地，纵坐标的值也增大，且呈现良好的线性关系。即随着Cu²⁺浓度的增大，相应地，系统的相对荧光值下降，当Cu²⁺浓度为10μM时，系统的相对荧光值达到最低值。因此，我们选定检测系统荧光值最佳的Cu²⁺浓度为10μM。

4.3.2pH和反应时间的影响

已有相关研究人员研究表明，当1.0mL pH为6的BR缓冲溶液、Phosphate冲溶液、C₇H₁₅NO₄S、C₈H₁₈N₂O₄S、NaAc-HAc以及Tris-Hcl分别作为缓冲溶液，系统的△F值分别为7.9、16.4、6.3、27.3、36.5和31.3，相应的，RSD％(相对标准差)为4.3、3.7、4.1、2.9、2.3和3.0。结果表明，当pH为6的NaAc-HAc作为缓冲液时，系统的△F达到最大值。不同pH的1mL NaAc-HAc缓冲溶液对系统△F值的影响也已作出评估。在pH为5时，BSA-AuNCs从溶液中沉淀出来，此时的pH接近BSA的等电点。在Ph为6-10的范围内，△F随着pH的增加而降低。这是因为Cu²⁺在高pH值(pH＞6.0)条件下能大量水解，降低系统的荧光恢复率。系统的△F值在pH为6时达到最大值。因此，选定系统反应的pH为6。

将1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH为6的NaAc-HAc缓冲液、10μM Cu²⁺溶液混合，并稀释至10mL，分别静置不同的时间，使用荧光分度计检测荧光值，其中激发波长为400nm,扫描范围为550nm-750nm，最大吸收峰在618nm处。对数据进行处理分析，得到“时间-荧光值”关系图如图5所示。从图5可知，溶液静置0-6min时，溶液的荧光值是急剧下降的；静置时间超过10min时，溶液的荧光值趋于平稳。因此，我们可以统一取系统的反应时间为20min。

BSA-AuNCs荧光生物传感器物检测多聚磷酸根离子浓度，须在最佳外界条件下进行，根据前面的研究结果及相关的文献报道，我们可以确定最佳检测条件为：反应温度为室温(25℃)，反应体系pH为6，反应时间为20min，Cu²⁺浓度为10μM。

4.4BSA-AuNCs荧光生物传感器对PPy的检测

BSA-AuNCs-Cu²⁺中加入金属螯合剂后，被猝灭的荧光可得到恢复，PPy是金属螯合剂，原理上可使BSA-AuNCs-Cu²⁺猝灭的荧光得到恢复。

取不同浓度的PPy溶液，分别加入1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH为6的NaAc-HAc缓冲液及1.00mL10μM的Cu²⁺溶液，溶液混合并稀释至10mL，静置20min，使用荧光分度计分别测其荧光值，其中激发波长为400nm，扫描范围为550nm-750nm，最大吸收峰在618nm处。所得数据进行处理，得出曲线图如图6(a)所示。从图6(a)可知，PPy浓度与荧光值呈现良好的线性关系，随着多聚磷酸根离子浓度的增大，其荧光值也相应地增大。即加入PPy，使BSA-AuNCs-Cu²⁺猝灭的荧光得到增加，且随着加入的PPy的浓度的增大，BSA-AuNCs-Cu²⁺被猝灭的荧光增加得更多。因此,可以利用BSA-AuNCs荧光生物传感器物对PPy的含量进行检测。

对该次实验所得数据再次进行整理，得出曲线图如图6(b)所示。由图可知，随着PPy浓度的增大，相应地，纵坐标的值也增大，且呈现良好的线性关系，充分验证了BSA-AuNCs荧光生物传感器物检测PPy的原理：Cu²⁺与BSA链中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs，该作用引起AuNCs团聚从而导致荧光降低；加入金属离子螯合剂PPy后，PPy与Cu²⁺螯合使Cu²⁺从BSA-AuNCs表面脱离出来，形成BSA-AuNCs，荧光恢复。

综上所述，本发明以BSA为模板，采用化学还原的方法成功制备了直径2nm的荧光生物传感器BSA-AuNCs，用以检测PPy的含量。实验结果表明，金纳米团簇在BSA的作用下形成BSA-AuNCs，具有红色的荧光。加入Cu²⁺时，Cu²⁺与BSA链中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs-Cu²⁺，致使荧光淬灭。接着加入金属螯合剂PPy，PPy具有更高的与Cu²⁺螯合的能力，与Cu²⁺螯合而使Cu²⁺从BSA-AuNCs表面脱离出来，使系统荧光恢复，且随着加入的多聚磷酸根离子浓度的增大，相应的，系统的荧光恢复得也越多。基于这样的原理，设计了BSA-AuNCs荧光生物传感器，用于检测水产品中PPy的含量。此方法线性范围为10nM-100nM，检出限为10nM，检测PPy灵敏、高效、快速，具有实用性。