一种蚕茧层活性物质总黄酮的评价方法与流程

本发明涉及一种快速检测蚕茧层中总黄酮苷元的方法，具体涉及生物材料中黄酮苷元槲皮素和山奈酚快速提取和鉴定方法。

背景技术：

蚕丝是由家蚕体内绢丝腺分泌出来的高分子纤维蛋白，主要有两条丝素纤维和覆盖其上的丝胶两部分组成。茧壳有60～70%的丝素纤维，还有约25%丝胶和5%非丝胶成分，这5%非丝胶组分主要包括碳水化合物、蜡质和色素等；在大造茧中非丝胶成分的含量要远远高于5%，有的接近20%。近年来对于丝胶及其非丝胶蛋白成份的功能研究较多，主要集中在抗氧化、抗肿瘤、促进细胞分裂、皮肤美白等方面。

由大造或由大造蚕培育出来的蚕茧层中，非丝胶蛋白成份主要以黄酮类化合物，特别是以黄酮苷形成的糖苷类化合物形式存在。有三种槲皮素三糖苷，quercetin 5,4’-di-O-β -D -glucopyranoside, quercetin 5, 7, 4’-tri-O-β -D -glucopyranoside, quercetin 5-O-β -D -glucopyranoside（参见文献：Tamura et al., Phytochemistry, 2002, 59, 275-278）。从大造茧中分离并鉴定到七中黄酮类化合物，其中包括三种槲皮素单糖苷，quercetin 5-O - β -D-glucoside, quercetin 7-O - β - D-glucoside和quercetin 4’-O - β -D -glucoside；两种山奈酚单糖苷，kaempferol 5-O - β - D -glucoside, kaempferol 7-O - β -D -glucoside和游离槲皮素和山奈酚（参见文献：Kurioka et al., Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, 2002, 66, 1396-1399.）。还发现了以前从未发现的两种C-脯氨酸槲皮素（参见文献：Hirayama et al., Phytochemistry, 2006, 67, 579-583.）。

传统的茧壳中总黄酮的测定方法是沿用以芦丁为标准品的传统比色方法。该方法以NaNO₂-Al(NO₃)₃为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮类物质生成红色铝螫合物为特征，以芦丁为对照，在510 nm处测定吸光度，从而得到待测物质总黄酮的估算含量。对这种方法的专属性已经有疑虑，发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大波长处（510 nm左右）有较强吸收，而黄酮类成分槲皮素、山柰酚及其苷类在此波长处没有吸收（参见文献： 药物分析杂志, 2002, 22(2), 97-99），故用这种方法估算总黄酮量会有很大的误差。因此，迫切地需要寻找出一种能精确评估茧壳中黄酮类物质含量的方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的不足，提供一种稳定性高，专属性强，且简单，快速，能准确测定茧壳中总黄酮的方法。

实现本发明目的的技术方案是提供一种蚕茧层活性物质总黄酮的评价方法，其特征在于：以醇-酸-水混合溶液为水解萃取液，在超声处理条件下，采用水解萃取方法，将槲皮素和山奈酚苷元从蚕茧壳的黄酮苷类化合物中释放，采用反相色谱柱分离后，检测蚕茧中的槲皮素和山奈酚的含量，以槲皮素和山奈酚的总和，对蚕茧层所含活性物质总黄酮进行评价。

本发明技术方案中，对水解萃取后的抽提液经微孔滤膜过滤，采用C₁₈反相色谱柱分离和HPLC-DAD二级管阵列检测器检测槲皮素和山奈酚的含量。

本发明所述的醇为甲醇或乙醇。所述的酸为盐酸或硫酸。

本发明的一个优选方案是：水解萃取液为甲醇-盐酸-水混合溶液，所述盐酸为质量浓度30～40%的盐酸溶液，甲醇-盐酸-水的体积比为7：2：1；水解萃取温度为50～90℃；超声处理的功率为400～600w，处理时间为0.5～3h。

其中，最优的方案是：水解萃取温度为75℃；超声处理的功率为600w，处理时间为1h。

本发明先对茧壳进行醇酸水解超声辅助提取的处理，再测定溶液中槲皮素和山奈酚的总量，以槲皮素和山奈酚的总和为茧壳所含总黄酮量，其原理是：茧壳中的黄酮苷类物质主要以槲皮素和山奈酚两种苷元存在，本发明通过一定的水解条件，将黄酮苷元从黄酮苷中释放出来。在五次平行试验中，得到槲皮素和山奈酚的量分别为1.98 mg/g 和 0.42 mg/g，相对标准差分别为3.01%和2.38%。槲皮素和山奈酚的回收率分别为99.56% 和 99.17%。通过酸水解-HPLC-DAD方法测得的总黄酮量（槲皮素和山奈酚的总和）为2.40 ±0.07 mg/g，以芦丁为标准品测得的总黄酮量(相当于芦丁的量)为2.40 ±0.07 mg/g，然而2.40 ±0.07 mg/g根据芦丁和槲皮素的分子量比却转化为1.28 ±0.04 mg/g槲皮素。

本发明采用醇酸水解超声辅助提取的方法，可以将样品中的黄酮苷元从黄酮苷中释放出来。大造茧壳中主要存在以槲皮素和山奈酚为苷元的黄酮类物质，因此可以通过HPLC-DAD定量的测定出来。这两种苷元的总和就用来评估茧壳中总黄酮的含量和表明达样品的生物活性。

由于本技术方案的采用，与已有技术相比，本发明的显著优点是：利用合理的酸解条件将黄酮苷元从黄酮苷中释放出来，再采用HPLC-DAD进行定量测定的技术，具有高效率、高精度的优点。

附图说明

图1是槲皮素、山奈酚标准品和本发明提供的茧壳水解提取物的HPLC图谱；

图2是本发明提供的酸水解-HPLC-DAD 方法测得的总黄酮含量和传统比色法测得的槲皮素含量的相关性分析图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述。

实施例1

本实施例测定的蚕茧品种为 ：黄绿色大造蚕茧、普通白茧和其他有色蚕茧。将洁净的茧壳剪成1×1mm碎片。

将一定量的槲皮素和山奈酚标准品溶解在甲醇中。配置五个浓度，每个浓度重复三次上样。取三次的面积平均值进行标准曲线的绘制。

将250mg大造茧壳碎片加入到10ml甲醇-盐酸-水（7/2/1，V/V/V）的三元溶液中（盐酸为市售的质量浓度为37%的盐酸溶液），在温度75℃、超声处理1小时的条件下进行水解。 取上清，HPLC-DAD测定样品中槲皮素和山奈酚总含量。重复五次平行实验，测定重现性。

将一定量的槲皮素和山奈酚的标准品加入到水解溶液中和定量的茧壳一起处理，测定回收率。

将250mg各种茧壳碎片加入到10ml甲醇-盐酸-水(7/2/1，V/V/V)的三元溶液中，75℃超声1小时进行水解。取上清，HPLC-DAD测定样品中槲皮素和山奈酚总含量。

传统方法测茧壳中总黄酮

将一定量的槲皮素和山奈酚标准品加入到有定量茧壳的三元溶液中，75℃超声1小时处理。取每次试验的上清进行HPLC-DAD测定，计算槲皮素和山奈酚的回收率。

取大造茧和不同彩色茧的茧壳碎片，加入60%乙醇，稀释至质量浓度为0.0333 g/ml，60℃水浴条件下避光提取6小时，重复提取3次。将两次的提取物抽提液合并，取上层清液，离心获得工作液。取5 ml工作液，加入到10 ml容量瓶中，加入0.3 ml 5%的NaNo₂ (5 min)，加入0.3 ml 17.6% 的Al(No₃)₃（6 min），加入4%的NaoH，用0.4 ml溶剂至刻度 （10 min）。510nm测吸光度。同样配置不同浓度的芦丁样品510 nm测吸光度，做标准曲线。

HPLC条件

色谱柱为安捷伦C₁₈色谱柱(250 × 4.6 mm)，流动相为甲醇-水-磷酸(50:50:0.4, V/V/V)，检测波长为370 nm，流速为1 ml/min。上层清液经0.45 μm滤头过滤，进样量为10 μl。

本实施例结果如下：

1、槲皮素和山奈酚的鉴定

利用反向色谱分析柱对水解物进行HPLC分析，参见附图1，它是槲皮素、山奈酚标准品和本实施例茧壳水解提取物的HPLC图谱，图中，(a )为槲皮素标准品和茧壳水解提取物对应峰的紫外-可见吸收光谱; (b )为山奈酚标准品和茧壳水解提取物对应峰的紫外-可见吸收光谱；从分析色谱图可以看出，保留时间13.17 min和23.15 min的位置有两个信号很强的峰，与标准品相同，分别为槲皮素和山奈酚。从色谱图DAD检测信号中调出的200～600nm的紫外可见光谱显示，该化合物在370 nm处有最大吸收，分别与标准品完全相同。进样量和峰面积具有很好的线性关系，分别为槲皮素：y = 110311+2599690x, R= 0.99289；和山奈酚 y = 15655.5+3452790x, R = 0.99464。

2、酸水解-HPLC-DAD 方法测定茧壳中槲皮素和山奈酚两中苷元的重现性

根据槲皮素和山奈酚各自的线性方程计算含量，通过五次测试，得到槲皮素和山奈酚的含量为1.98 mg/g 和 0.42 mg/g，其相对标准差为3.01% 和 2.38%。以上数据说明酸水解-HPLC-DAD 方法测定槲皮素和山奈酚两中苷元的方法具有很好的重现性。本实施例提供的酸水解-HPLC-DAD 方法测定茧壳中槲皮素和山奈酚两中苷元的重现性，结果参见表1。

表1酸水解-HPLC-DAD 方法测定茧壳中槲皮素和山奈酚两中苷元的重现性

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3、酸水解-HPLC-DAD 方法测定茧壳中槲皮素和山奈酚两中苷元的回收率

为了了解本发明采用的酸水解-HPLC-DAD测定茧壳中槲皮素和山奈酚两种苷元的回收率，将一定量的槲皮素和山奈酚的标准品加入到水解溶液中和定量的茧壳一起处理。通过各自的线性方程计算含量，进一步计算槲皮素和山奈酚的回收率为99.56%和99.17%，其相对标准差为±1.69%和±1.57%。以上数据说明采用的酸水解-HPLC-DAD测定茧壳中槲皮素和山奈酚两种苷元具有良好的回收率。采用本实施例提供的酸水解-HPLC-DAD 方法测定茧壳中槲皮素和山奈酚两中苷元的回收率，结果参见表2。

表2 酸水解-HPLC-DAD 方法测定茧壳中槲皮素和山奈酚两中苷元的回收率

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4、酸水解-HPLC-DAD 方法与传统的比色方法的对比

为了充分比较酸水解-HPLC-DAD 方法与传统的比色方法的差异，本实施例选取普通白茧和一些其他的彩色茧进行分析。结果发现，在不同茧壳中两种糖苷的含量有很大不同。通过酸水解-HPLC-DAD 方法测得1-427在所有茧壳中两种糖苷含量最高(3.22 mg/g)，用传统比色方法测得的槲皮素含量却为1.02 mg/g。在白色茧壳中通过酸水解-HPLC-DAD 方法几乎没有测到两种糖苷的存在，然而通过传统比色方法却有0.24 mg/g槲皮素。在大造茧中，通过本发明测得有2.4 mg/g 的槲皮素糖苷，通过传统方法却有其一半含量的槲皮素。以上数据说明，传统的比色方法并不能真正的反应出茧壳中总黄酮的含量。两种方法测得的茧壳中总黄酮的含量参见表3。

表3 两种方法测得的茧壳中总黄酮的含量 (mg/g ±SD)

Q+K 是槲皮素和山奈酚含量的和, “槲皮素”为用传统的比色方法测得的总黄酮量根据芦丁和槲皮素的分子量比转化为槲皮素的量。

参见附图 2，它是本实施例提供的酸水解-HPLC-DAD 方法测得的总黄酮含量和传统比色法测得的槲皮素含量的相关性分析图；图2结果显示，将两种方法测得的总黄酮进行相关性分析，可以看到两组数据几乎没有相关性(R =0.62)。

本发明建立的酸水解-HPLC-DAD 方法能够把茧壳中的黄酮苷元从黄酮苷中高效的水解出来，并能快速的进行总黄酮的定量测定。最优化的条件为在甲醇-盐酸-水(7/2/1, V/V/V)的三元溶液中，温度为75℃、超声处理时间为1h。

本发明技术方案不仅具有很好的重复性还有非常高的回收率，相比传统的以芦丁为标准品的比色方法，具有更高的准确性和专属性。本发明技术方法还可用于桑叶、桑枝、桑根和桑椹中黄酮苷元的快速分析。本发明对于蚕茧资源的综合利用特别是特色家蚕、桑树新品种的培育具有重要的指导意义。