一种用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电化学传感器及其制备方法与流程

本发明涉及电分析化学技术领域，具体涉及一种用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电化学传感器及其制备方法。

背景技术：

沙丁胺醇化学名称为1-(4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，又称舒喘灵、柳丁胺醇、咳宁，它是一种具有选择性的β-肾上腺素受体兴奋剂。沙丁胺醇可通过对羟基苯乙酮经氯甲基化、酯化等一系列化学反应制得，其主要用于支气管哮喘、喘息性支气管炎、肺气肿和慢性充血性心肾衰竭，药理作用是通过有效抑制组胺致过敏性物质的释放，防止支气管痉挛、肺气肿等。沙丁胺醇还可促进动物生长，使动物体内的营养成分由脂肪组织向肌肉组织转化，因此还被称之为“瘦肉精”。由于沙丁胺醇会在动物组织中残留，可通过食物链进入人体，会导致头痛、头晕、失眠等症状，还有肌肉和手指颤抖、心悸、血压波动等不良反应发生，对人体健康造成严重影响。因此，为保障食品安全和人类身心健康，非常有必要建立一种快速、简便的沙丁胺醇检测方法。

目前用于沙丁胺醇测定的主要方法有色谱法、化学发光法、荧光法和酶联免疫法等。但是这些方法或仪器价格昂贵，或分析过程繁琐或检测灵敏度较低，无法进行现场快速分析和连续在线监测。而电化学传感方法因为其灵敏度高、响应快、成本低和设备简单等优点被广泛应用。电化学传感器中的工作电极未经修饰直接使用会导致被分析物的电化学响应弱，分析灵敏度不高。如文献报道的在DNA作用下裸玻碳电极上沙丁胺醇的检出限为511nm(Wang Y,Ni Y,Kokot S,Analytical Biochemistry,419(2011)76–80)，在碳纳米管修饰电极和壳聚糖/多壁碳纳米管修饰电极上沙丁胺醇的检出限分别为100nm(Lin K C,Hong C P,Chen S M,Sensors and Actuators B 177(2013)428–436)和86nm(Cao Z,Zhao T Y,Dai Y M,Long S,Guo X C,Yang R H,Sensor letters(2011)1985–1989)。尽管电极经过常规碳纳米材料修饰后检出限有所降低，但考虑到电化学方法的灵敏性，这些检出限仍有进一步降低的空间。另外，传统化学修饰电极在实际样品检测中容易受到其它电活性物质的干扰，导致其选择性降低。因此，发展一种既能提高传感器灵敏度，也能提高其选择性的方法尤为重要。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中存在的上述不足，提供一种用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电化学传感器及其制备方法。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电极的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

S1.将氧化石墨烯分散在水中，得分散液，氧化石墨烯和水的用量比为1mg:1～3mL；

S2.将分散液的pH值调至9～11，然后在搅拌条件下加入尿素形成混合液，尿素的加入质量为步骤S1中所述氧化石墨烯质量的80～150倍；

S3.将上述混合液在15～30℃下搅拌20～50min后，加热至100～130℃反应8～16h；

S4.将步骤S3得到的反应液冷却后离心取沉淀，洗涤、干燥后得氮掺杂还原氧化石墨烯(N-RGO)；

S5.取氮掺杂还原氧化石墨烯在水中超声分散，然后加入葡萄糖形成溶液A，所述的氮掺杂还原氧化石墨烯、水和葡萄糖的用量比为1～3mg:1～3mL:10～30mg；

S6.将NH₃·H₂O溶液加入到硝酸银溶液中，先出现沉淀，继续加入NH₃·H₂O溶液直至沉淀消失得到银氨溶液(Ag(NH₃)₂OH溶液)，形成溶液B，所述的NH₃·H₂O的浓度为0.3～0.4mol/L，硝酸银溶液的浓度为0.03～0.05mol/L；

S7.将溶液B和溶液A混合，搅拌反应0.5～2h，然后陈化3～6h，经离心、洗涤、干燥得银/氮共掺杂还原氧化石墨烯(Ag-N-RGO)纳米复合材料，所述溶液B和溶液A的体积比为1:1～3；

S8.取银/氮共掺杂还原氧化石墨烯纳米复合材料分散于有机溶剂中，然后涂覆在工作电极的表面，得银/氮共掺杂还原氧化石墨烯修饰电极(Ag-N-RGO修饰电极)，所述的银/氮共掺杂还原氧化石墨烯纳米复合材料与有机溶剂的用量比为1mg:1～2mL；

S9.将银/氮共掺杂还原氧化石墨烯修饰电极置于含1.0～2.0mmol/L邻苯二胺和0.3～1.0mmol/L沙丁胺醇的PBS缓冲溶液中进行循环伏安法扫描；

S10.将经步骤S9处理过的电极置于0.2～0.5mol/L的H₂SO₄溶液中进行循环伏安法扫描除去聚合膜中的沙丁胺醇，得银/氮共掺杂还原氧化石墨烯基印迹电极(MIP/Ag-N-RGO印迹电极)，即所述的用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电极。

对于使用纳米复合材料制备测定具体某种化学成分含量的电极，则需要发明人根据具体待测定的化学物质的性质制备不同的纳米复合材料。制备出的电极对所要测定物质的检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的好坏主要由纳米复合材料的制备方法决定。纳米复合材料的制备方法主要包括原材料的选择、原材料的配比，以及各个步骤反应条件等。对于用作电极的纳米复合材料，其制备方法中原材料的选择、配比以及各个步骤反应条件的不同都会导致后续制备得到的电极电性能的巨大差异，从而导致检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的巨大差异。

根据沙丁胺醇的特性，为得到具有高选择性和低检出限的沙丁胺醇检测电极，本发明发明人通过大量的实验，不断调整原料组成、配比以及制备过程中的工艺参数；制备得到粒径为10～30nm的Ag纳米粒子并成功将其均匀的锚钉在氮掺杂还原氧化石墨烯片层上，该工艺也成功克服了石墨烯片层容易团聚的现象，使得制备得到的Ag-N-RGO修饰电极具有优异的电化学响应性能，将具有特异识别性能的分子印迹膜进一步电聚合在该复合膜修饰电极上，得到MIP/Ag-N-RGO印迹电极，该电极可以显著降低样品中沙丁胺醇的检出限，以及提高检测的灵敏度、稳定性与抗干扰性。

优选地，步骤S1中氧化石墨烯和水的用量比为1mg:2～3mL。

最优选地，氧化石墨烯和水的用量比为1mg:2mL。

优选地，步骤S2中尿素的加入质量为步骤S1中所述氧化石墨烯质量的100～150倍。

最优选地，尿素的加入质量为步骤S1中所述氧化石墨烯质量的100倍。

优选地，步骤S2中用质量分数为20～40％的NH₃·H₂O调节分散液的pH值至9～11。

最优选地，用质量分数为30％的NH₃·H₂O调节分散液的pH值至10。

优选地，步骤S3中所述的加热是在水热反应釜进行加热；加热至120～130℃反应10～14h。

最优选地，加热至120℃反应12h。

优选地，步骤S5中所述的氮掺杂还原氧化石墨烯、水和葡萄糖的用量比为1～2mg:1～2mL:20～30mg。

最优选地，所述的氮掺杂还原氧化石墨烯、水和葡萄糖的用量比为1mg:1mL:21mg；步骤S6中所述的NH₃·H₂O的浓度为0.37mol/L，硝酸银溶液的浓度为0.04mol/L。

优选地，步骤S7中所述溶液B和溶液A的体积比为1:2；搅拌反应1～2h，然后陈化5～6h。

最优选地，搅拌反应1h，然后陈化5h。

优选地，步骤S8中所述的银/氮共掺杂还原氧化石墨烯纳米复合材料与有机溶剂的用量比为1mg:1mL；步骤S8中所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺。

优选地，步骤S9中邻苯二胺的浓度为1.5mmol/L，沙丁胺醇的浓度为0.5mmol/L；步骤S9中所述的循环伏安法扫描电压为-0.3～1.0V，扫速为0.05V/s，循环聚合圈数为10圈。

优选地，步骤S10中H₂SO₄溶液的浓度为0.3mol/L；步骤S10中循环伏安法扫描电压为-0.3～1.0V，扫速为0.05V/s。

一种用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：将上述制备得到的银/氮共掺杂还原氧化石墨烯基印迹电极为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为辅助电极，利用三电极法组装电极测试体系，连接电化学工作站得用于沙丁胺醇定量检测的电化学传感器。

本发明还提供一种由上述制备方法制备得到的用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电化学传感器。

一种沙丁胺醇定量检测的方法，使用上述电化学传感器，用差分脉冲伏安法检测样品中的沙丁胺醇含量，所述差分脉冲伏安法检测的具体条件为：底液为pH 6.4的磷酸缓冲液，富集时间为120s；所述的差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量0.0035V、振幅0.050V、脉冲宽度0.055s、测样宽度0.017s、脉冲周期0.45s；线性回归方程为：i_pa(μA)＝0.1288C(μmol/L)+0.4536(R²＝0.9925)，该方程中C为沙丁胺醇浓度，i_p为差分脉冲伏安法得到氧化峰电流值。沙丁胺醇在0.03～20.00μmol/L浓度范围内与其氧化峰电流值之间呈良好线性关系。

有益效果：(1)本发明提供了一种全新的用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型化学电极以及化学传感器，该电极或传感器对沙丁胺醇具有优异的选择性；(2)所述的用于沙丁胺醇定量检测的化学电极或化学传感器具有极低的检出限(实施例表明其检出限为7.0nmol/L，远远低于现有技术中的511nmol/L、100nmol/L和86nmol/L)以及良好的稳定性、抗干扰性和重现性；(3)基于本发明构建的沙丁胺醇电化学传感器操作简单、成本低廉，在药品食品质量控制、临床辅助医疗和环境监测等方面有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明所述的Ag-N-RGO纳米复合材料的扫描电镜图(A)、透射电镜图(B)、能谱图(C)和拉曼光谱图(D)。

图2为本发明所述的MIP/Ag-N-RGO印迹电极的制备过程。

图3为本发明所制备的MIP/Ag-N-RGO印迹电极(a)和NIP/Ag-N-RGO非印迹电极(b)在10mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4-+0.1mol/L KCl溶液中的循环伏安(A)和交流阻抗(B)图谱。

图4沙丁胺醇在MIP/Ag-N-RGO印迹电极(a)和NIP/Ag-N-RGO非印迹电极(b)上的循环伏安曲线。

图5(A)不同浓度沙丁胺醇在MIP/Ag-N-RGO印迹电极上的DPV曲线，(B)不同浓度沙丁胺醇在MIP/Ag-N-RGO印迹电极上与其氧化峰电流值之间的线性关系图。

图6沙丁胺醇和干扰物质在MIP/Ag-N-RGO印迹电极和NIP/Ag-N-RGO非印迹电极上的电流响应。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电极的制备(MIP/Ag-N-RGO电极的制备)

S1.将氧化石墨烯分散在水中，得分散液，所述的氧化石墨烯和水的用量比为1mg:2mL；

S2.用质量分数为30％的NH₃·H₂O将分散液的pH值调至10，然后在搅拌条件下加入尿素形成混合液，所述的尿素的加入质量为步骤S1中所述氧化石墨烯质量的100倍；

S3.将上述混合液在水热反应釜进行加热至120℃反应12h；

S4.将步骤S3得到的反应液冷却后离心取沉淀，洗涤、干燥后得氮掺杂还原氧化石墨烯(N-RGO)；

S5.取氮掺杂还原氧化石墨烯在水中超声分散，然后加入葡萄糖形成溶液A，所述的氮掺杂还原氧化石墨烯、水和葡萄糖的用量比为1mg:1mL:21mg；

S6.将NH₃·H₂O溶液加入到硝酸银溶液中，先出现沉淀，继续加入NH₃·H₂O溶液直至沉淀消失得到银氨溶液(Ag(NH₃)₂OH溶液)，形成溶液B，所述的NH₃·H₂O的浓度为0.37mol/L，硝酸银溶液的浓度为0.04mol/L；

S7.将溶液B和溶液A混合，搅拌反应1h，然后陈化5h，经离心、洗涤、干燥得银/氮共掺杂还原氧化石墨烯(Ag-N-RGO)纳米复合材料，所述溶液B和溶液A的体积比为1:2；

S8.取银/氮共掺杂还原氧化石墨烯纳米复合材料分散于二甲基甲酰胺中，然后涂覆在工作电极的表面，得银/氮共掺杂还原氧化石墨烯修饰电极(Ag-N-RGO修饰电极)，所述的银/氮共掺杂还原氧化石墨烯纳米复合材料与有机溶剂的用量比为1mg:1mL；所述的工作电极为玻碳电极；

S9.将银/氮共掺杂还原氧化石墨烯修饰电极置于含1.5mmol/L邻苯二胺和0.5mmol/L沙丁胺醇的PBS缓冲溶液中进行循环伏安法扫描；所述的循环伏安法扫描电压为-0.3～1.0V，扫速为0.05V/s，循环聚合圈数为10圈；

S10.将经步骤S9处理过的电极置于0.3mol/L的H₂SO₄溶液中进行循环伏安法扫描除去聚合膜中的沙丁胺醇，得银/氮共掺杂还原氧化石墨烯基印迹电极(MIP/Ag-N-RGO印迹电极)。

图1显示步骤S7制备得到的Ag-N-RGO纳米复合材料在2000倍(A)和50000倍(B)放大倍率下的扫描电镜和透射电镜图，从图中可见小尺寸的Ag纳米颗粒随机高分散在还原氧化石墨烯片层上，整个复合材料呈现出皱褶、多层状结构，负载的金属纳米粒子粒径在10–30nm之间。纳米颗粒尺寸小、分散度高且无团聚现象，有利于提高复合膜修饰电极的电催化活性比表面积。另外，能谱分析结果(C)显示，复合材料中主要除了N、C、O外还含有Ag元素，说明Ag纳米颗粒的成功负载在N-RGO上。拉曼光谱分析结果(D)显示氧化石墨烯(GO)、N掺杂还原氧化石墨烯(N-RGO)和Ag/N掺杂还原氧化石墨烯(Ag-N-RGO)都出现了明显的D峰和G峰，分别对应着石墨材料中C原子的SP³振动和石墨烯材料面内的sp²振动。同时，D/G峰强度比反应了所在碳材料的缺陷密度。Ag-N-RGO和N-RGO的D/G峰强度比分别为1.23和1.05，远远大于GO的D/G峰强度比0.48，说明了N和Ag掺杂进石墨烯材料会引起了石墨烯片层的扭曲或石墨烯晶格上产生了新的缺位，进一步证实了Ag成功负载在N-RGO片层上。

图2给出了步骤S9关于制备MIP/Ag-N-RGO印迹电极的示意图。从图中可见，分子印迹电极的制备过程主要包括了电极修饰、电聚合、去除模板分子等步骤，得到的分子印迹膜电极表面具有许多空穴的多孔结构，有利于对模板分子进行特异性识别，同时提高了沙丁胺醇在电极表面的传质速率，也有利于提高沙丁胺醇电氧化过程的电子转移速率。

对比例1银/氮共掺杂还原氧化石墨烯基非印迹电极的制备(NIP/Ag-N-RGO非印迹电极的制备)

NIP/Ag-N-RGO电极的制备步骤中S1～S8同实施例1；步骤S9为：将银/氮共掺杂还原氧化石墨烯修饰电极置于在含1.5mmol/L邻苯二胺的PBS缓冲溶液中于-0.3～1.0V之间以0.05V/s的扫速循环聚合10圈后得到NIP/Ag-N-RGO非印迹电极。

实施例2一种用于沙丁胺醇定量检测的电化学传感器

将实施例1制备得到的MIP/Ag-N-RGO印迹电极作为工作电极，以铂丝电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组装成三电极测试体系，并连接电化学工作站得用于沙丁胺醇定量检测的电化学传感器。

实施例3用于沙丁胺醇定量检测的电化学传感器的电学性能测试

(1)不同电极的电子传递性能对比

在如实施例2制备得到的三电极测试体系中，分别以MIP/Ag-N-RGO印迹电极(a)和NIP/Ag-N-RGO非印迹型电极(b)为工作电极，在10mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4-混合0.1mol/L KCl的底液中进行循环伏安和交流阻抗测试，伏安测试条件为：扫描范围-0.2～0.6V，扫描速度0.1V/s；交流阻抗测试条件为：频率范围10⁵～0.1HZ、振幅5mV、电位0.20V，测试结果如图3。从图3可见[Fe(CN)₆]^3-/4-探针离子在分子印迹膜电极上的峰电流响应大于其对于的非印迹膜电极上的电流响应，电化学阻抗在上述两种电极上分别为130kΩ和160kΩ，说明本发明提供的MIP/Ag-N-RGO印迹电极提高了其表面传质速率和电子转移速率，且MIP/Ag-N-RGO印迹电极有利于提高传感器对沙丁胺醇的特异性识别能力，既有利于提高传感器的选择性。

(2)不同电极对沙丁胺醇的电催化性能对比

在如实施例2制备得到的三电极测试体系中，分别以MIP/Ag-N-RGO印迹电极(a)和NIP/Ag-N-RGO非印迹型电极(b)为工作电极在0.1mmol/L沙丁胺醇溶液中进行循环伏安测试，测试的电位范围为0.3～0.8V、扫描速度为0.1V/s，图4为测试结果。从图中可见沙丁胺醇在本发明所述的MIP/Ag-N-RGO印迹电极上的氧化峰电流最大(11.5μA)，且峰电位为0.540V。与NIP/Ag-N-RGO做工作电极时相比，沙丁胺醇在本发明所述的MIP/Ag-N-RGO印迹电极上的氧化超电势下降了约20mV，说明了本发明所制备的MIP/Ag-N-RGO印迹电极对沙丁胺醇有着较好的电催化活性，有利于提高传感器的灵敏度。

(3)本发明制备得到的电化学传感器的电化学检测性能测试

将实施例1制备得到的MIP/Ag-N-RGO印迹电极利用三电极法组装电极测试体系，并连接电化学工作站(构建方法如实施例2所示)；在pH为6.4的磷酸底液中，以富集时间为120s，对一系列沙丁胺醇溶液进行差分脉冲伏安法测试。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量0.0035V、振幅0.050V、脉冲宽度0.055s、测样宽度0.017s、脉冲周期0.45s。结果表明(见图5)沙丁胺醇的氧化峰电流随其浓度增加而增大，在0.03～20.00μmol/L浓度范围内与其氧化峰电流值之间呈良好线性关系，线性回归方程为：i_pa(μA)＝0.1288C(μmol/L)+0.4536(R²＝0.9925)，该方程中C为沙丁胺醇浓度，i_p为差分脉冲伏安法得到氧化峰电流值；检出限计算为7.0nmol/L。说明本发明所制备得到的电极具有良好的线性关系和极低的检出限。

(4)本发明制备得到的MIP/Ag-N-RGO印迹电极的稳定性和重现性测试

按照实施例1的步骤制备6支相同的MIP/Ag-N-RGO印迹电极，分别以这6支电极为工作电极，用三电极法组装电极测试系统并连接电化学工作站(构建方法如实施例2所示)，在pH为6.4的磷酸底液中，以富集时间为120s，利用差分脉冲伏安法对同一浓度的沙丁胺醇进行测定。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量0.0035V、振幅0.050V、脉冲宽度0.055s、测样宽度0.017s、脉冲周期0.45s，测定结果的相对标准偏差为4.13％。将其中一支MIP/Ag-N-RGO印迹电极保存在4℃冰箱中，选取6个不同的时间段(保存前测试第1次，然后每隔1天测试1次)，利用上述同样条件和方法对同一浓度的沙丁胺醇进行测定，测定的相对标准偏差为1.96％；表明本发明提供的MIP/Ag-N-RGO印迹电极具有较好的稳定性和重现性。

(5)本发明制备得到的MIP/Ag-N-RGO印迹电极的检测选择性测试

为进行对比说明，将实施例1制备得到的MIP/Ag-N-RGO印迹电极和NIP/Ag-N-RGO非印迹电极利用三电极法组装电极测试体系，并连接电化学工作站构成电化学传感器(构建方法如实施例2所示)，利用差分脉冲伏安法考察了几种结构类似物和实际样品中常共存的几种外来干扰物质对沙丁胺醇测定的影响。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量0.0035V、振幅0.050V、脉冲宽度0.055s、测样宽度0.017s、脉冲周期0.45s。具体测试方法是，在pH为6.4的磷酸底液中调节沙丁胺醇浓度为10μM，以富集时间为120s通过差分脉冲伏安法测定其氧化峰电流值；再用相同的电极在相同条件下对10倍浓度的干扰物质进行测定。如图6结果所示，克伦特罗、莱克多巴胺、特布他林、多巴胺、肾上腺素、抗坏血酸和尿酸等干扰物质在MIP/Ag-N-RGO印迹电极上的电流响应比沙丁胺醇低5.6倍以上，说明了本发明提供的电极具有较好的检测选择性。另外，测定了这些干扰物质和沙丁胺醇在NIP/Ag-N-RGO非印迹电极上的电流响应，将其在印迹电极与非印迹电极上的氧化峰电流值之比作为印迹因子，得到沙丁胺醇的印迹因子为11.2；克伦特罗、莱克多巴胺、特布他林、多巴胺、肾上腺素、抗坏血酸和尿酸的印迹因子分别为1.35、1.43、1.22、1.21、1.05、1.03和1.07；进一步说明本发明制备的MIP/Ag-N-RGO印迹电极对沙丁胺醇具有较好的特异识别能力，能快速有效地识别模板分子，并给出准确检测结果。

实施例4实际样品检测

将某地市售猪肉取100mg，切碎后，将其置于10mL纯净水中超声2h后过滤，将滤液用pH为6.4的磷酸溶液定容至1L作为实测样品。将实施例1制备得到的MIP/Ag-N-RGO印迹电极利用三电极法组装电极测试体系，并连接电化学工作站构成电化学传感器，利用差分脉冲伏安法测定上述样品中的沙丁胺醇含量。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量0.0035V、振幅0.050V、脉冲宽度0.055s、测样宽度0.017s、脉冲周期0.45s。具体测试方法是，取上述实测样品5mL，依次加入标准沙丁胺醇溶液含量为0μM、5μM、10μM，调节底液pH为6.4，以富集时间为120s通过差分脉冲伏安法测定沙丁胺醇的氧化峰电流值，根据实施例3得到的线性关系找到对应的沙丁胺醇浓度值。根据上述方法得到沙丁胺醇测定值的相对标准偏差在2.72～3.95％之间，回收率在103.6～105.3％之间；说明了本发明提供的化学电极或传感器可用于食品、药品等实际样品中沙丁胺醇含量的准确测定。