一种乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法与流程

本发明涉及食品中双酚类化合物检测的技术领域，尤其涉及一种乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法。

背景技术：

双酚A(BPA)和双酚二缩水环氧甘油醚(BADGE)是聚碳酸酯和环氧树脂的功能单体，其可用于酚醛树脂、可塑性聚酯的抗氧剂及聚氯乙烯稳定剂等。在塑料制品的制造过程中，添加双酚A(BPA)或者双酚二环氧甘油醚(BADGE)可以使其具有无色透明、耐用、轻巧和突出的防冲击性等特性。在生产有机溶胶树脂的过程中，树脂热固化过程中会产生盐酸，从而导致聚合物热降解，通过添加BADGE类物质是可吸附树脂热固化过程中产生的盐酸。

聚碳酸酯和环氧树脂广泛用于食物和饮料容器、餐具、金属罐头的衬里和盖子、奶瓶、玩具、医疗设备、牙齿填充物等物品中。双酚类及其衍生物可通过这些食品包装材料渗入食品而进入体内。越来越多的研究发现，双酚A具有类雌激素和抗雄激素效应，会引起性早熟、代谢疾病，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、甲状腺和肝脏功能疾病等，因此2005年欧盟对双酚A及部分衍生物在食品中的限量做出了规定。这一政策的出台使得食品接触材料的生产商纷纷寻找双酚A的结构类似物，如BPB,BPC,BPF,BPS等,来替代双酚A，不幸的是近几年的研究表明双酚A结构类似物并不比双酚A安全，因此有必要建立一套比较完善的检测方法监测双酚类及其衍生物，为食品的安全控制提供依据。

目前报道的食品及其接触包装材料中双酚类化合物的检测方法主要集中在高效液相色谱荧光检测法，高效液相色谱串联质谱法和气相色谱质谱法。GC-MS法(气相质谱法)对同时分析该类化合物存在一定的局限性，因为双酚类及环氧衍生物的熔点高，一般需要柱后或柱前衍生法，操作较为繁琐。双酚类化合物结构中均含两个及以上的苯环，且在苯环的对位上有羟基等给电子基团，具有荧光特性，故可以使用HPLC-FLD(高效液相色谱荧光检测法)检测，但液相检测仅靠保留时间定性，易出现假阳性，对前处理要求也高，耗时费力。

技术实现要素：

为克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法，其可高效、快速、准确、全面地检测出乳制品中存在的双酚类化合物，操作方便，重现性好。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

样品处理及检测

将待测乳制品置于具塞比色管中，加入提取溶剂、硫酸镁和乙酸钠，经涡旋后静置，取上清液转移至另一个比色管中，加入硫酸镁和N-丙基乙二胺和C18净化，经涡旋后静置，取上清液氮吹近干，并用甲醇和水复溶，经涡旋后过滤膜，取过滤后的液体进样至HPLC-MS/MS上检测分析；

制作标准曲线

将多种双酚类化合物标准品分别置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成单标储备液；取相同体积的各双酚类化合物的单标储备液进行混合，并加甲醇和水稀释成中间液，再取中间液加甲醇和水稀释，配制成多种浓度的混合标准工作液，注入HPLC-MS/MS上测定，得到多种双酚类化合物的标准曲线；

测定样品中各酚类化合物的浓度

将样品处理及检测过程中得到的检验数据通过标准曲线计算待测样品中双酚类化合物的浓度。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述双酚类化合物包括双酚A、双酚B、双酚F、四溴双酚A、双酚F缩水甘油醚、双酚F双(2,3-二羟基丙基)醚、双酚F-双(2-氯-1-丙醇)醚、六氟双酚A、双酚Z、双酚A缩水甘油醚、双酚C、双酚Z、双酚AP、双酚S、四氯双酚A、双酚A(2,3-二羟基丙基)缩水甘油醚、双酚A二(2,3-二羟基丙基)醚、双酚A(3-氯-2-羟丙基)缩水甘油醚、双酚A二(3-氯-2-羟丙基)醚、双酚A(3-氯-2-羟丙基)(2,3-二羟基丙基)醚及4,4’-磺酰二(2-甲基苯酚)。

进一步，在提取过程中，所述提取溶剂为含有体积分数为1％乙酸的乙腈，含有体积分数为1％乙酸的乙腈的添加量满足每克乳制品中加入2.5-3.5ml，硫酸镁的添加量满足硫酸镁与乳制品的质量比为0.6-1:1，乙酸钠的添加量满足乙酸钠与乳制品的质量比为0.2-0.4:1；在净化上清液的过程中，硫酸镁的添加量满足每毫升上清液加入硫酸镁的质量为6-10mg，N-丙基乙二胺的添加量满足每毫升上清液加入N-丙基乙二胺的质量为30-40mg，C18的添加量满足每毫升上清液加入15-25mg。

进一步，含有体积分数为1％乙酸的乙腈的添加量满足每克乳制品中加入3ml。

进一步，在稀释单标储备液获得中间液的过程中，甲醇和水的添加量满足甲醇与水的体积比为0.2-0.3:1。

进一步，HPLC-MS/MS的质谱条件为：正离子模式和负离子模式同时扫描及多反应监测模式，干燥气温度：220℃，干燥气流速：14L/min，雾化气压力：20Psi，鞘气温度：300℃，鞘气流量：11L/min，喷嘴电压：1500V，细管电压：3000V。

进一步，HPLC-MS/MS中采用的色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18柱或ACOUITY UPLC BEH C18柱。

进一步，HPLC-MS/MS中色谱柱的柱温为30-50℃。

进一步，HPLC-MS/MS中色谱柱的柱温为40℃。

进一步，HPLC-MS/MS中流动相为甲醇和水。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、采用HPLC-MS/MS法，能同时利用液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度鉴定能力对乳制品中的多种双酚类化合物进行分离和鉴定，分离效率高，鉴定准确；2、采用1％乙酸乙腈作为提取溶剂，其沉淀蛋白能力更强，萃取的脂肪等亲脂性成分更少，提取液更干净；另外，其提取的21种双酚类化合物的回收率均较高；3、以甲醇-水作为流动相，更有助于正扫描模式的离子化，提高了灵敏度。

附图说明

图1为两种色谱柱下BFDGE同分异构体的多反应监测离子图；

图2为两种流动相下目标物的总离子流图；

图3为两种流动相下BFDGE同分异构体的提取离子流图；

图4为不同柱温下BFDGE同分异构体的质谱多反应监测图；

图5为在不同提取溶剂下目标物回收率的对比图；

图6为在提取溶剂的不同体积下目标物回收率的对比图；

图7至9为响应面分析的立体图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例一

本实施例提供的乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法，其包括以下步骤：

样品处理及检测

将待测乳制品置于具塞比色管中，加入提取溶剂、硫酸镁和乙酸钠，经涡旋后静置，取上清液转移至另一个比色管中，加入硫酸镁和N-丙基乙二胺和C18净化，经涡旋后静置，取上清液氮吹近干，并用甲醇和水复溶，经涡旋后过滤膜，取过滤后的液体进样至HPLC-MS/MS上检测分析；

制作标准曲线

将多种双酚类化合物标准品分别置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成单标储备液；取相同体积的各双酚类化合物的单标储备液进行混合，并加甲醇和水稀释成中间液，再取中间液加甲醇和水稀释，配制成多种浓度的混合标准工作液，注入HPLC-MS/MS上测定，得到多种双酚类化合物的标准曲线；

测定样品中双酚类化合物的浓度

将样品处理及检测过程中得到的检验数据通过标准曲线计算待测样品中双酚类化合物的浓度。

本实施例的其中一个实施方式中，针对21种双酚类化合物分别制备一系列浓度的标准工作液，并分别注入HPLC-MS/MS上测定，得到21种双酚类化合物的标准曲线，并经过对乳制品的前处理，可有效提取乳制品中双酚类化合物，为市场上乳制品的双酚类化合物的筛查提供了技术支持。

其中的21种双酚类化合物分别为：双酚A(BPA)、双酚B(BPB)、双酚F(BPF)、四溴双酚A(TBBPA)、双酚F缩水甘油醚(BFDGE)、双酚F双(2,3-二羟基丙基)醚(BFDGE-2H2O)、双酚F-双(2-氯-1-丙醇)醚(BFDGE-2HCl)、六氟双酚A(双酚AF)、双酚Z(BPZ)、双酚A缩水甘油醚(BADGE)、双酚C(BPC)、双酚Z(BPZ)、双酚AP(BPAP)、双酚S(BPS)、四氯双酚A(TCBPA)、双酚A(2,3-二羟基丙基)缩水甘油醚(BADGE-H2O)、双酚A二(2,3-二羟基丙基)醚(BADGE-2H2O)、双酚A(3-氯-2-羟丙基)缩水甘油醚(BADGE-HCl)、双酚A二(3-氯-2-羟丙基)醚(BADGE-2HCl)、双酚A(3-氯-2-羟丙基)(2,3-二羟基丙基)醚(BADGE-H2O-HCl)及4,4’-磺酰二(2-甲基苯酚)(DMBPS)。

在目标物的提取过程中，含有体积分数为1％乙酸的乙腈的添加量满足每克乳制品中加入2.5-3.5ml，优选地，含有体积分数为1％乙酸的乙腈添加量满足每克乳制品中加入3ml，硫酸镁的添加量满足硫酸镁与乳制品的质量比为0.6-1:1，乙酸钠的添加量满足乙酸钠与乳制品的质量比为0.2-0.4:1；在净化上清液的过程中，硫酸镁的添加量满足每毫升上清液加入硫酸镁的质量为6-10mg，N-丙基乙二胺的添加量满足每毫升上清液加入N-丙基乙二胺的质量为30-40mg，C18的添加量满足每毫升上清液加入15-25mg。在稀释单标储备液获得中间液的过程中，甲醇和水的添加量满足甲醇与水的体积比为0.2-0.3:1，优选地，甲醇与水的体积可为1:1。

通过本实施例提供的乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法，其可高效、快速、准确、全面地检测出乳制品中存在的双酚类化合物，操作方便，重现性好。

实施例二

为提高本实施例提供的检测方法的检测全面性和准确率，本实施例分别对不同的样品处理方法进行了对比分析，并对HPLC-MS/MS的不同实验条件进行了对比分析，优化本实施例提供的检测方法，便于全面检测上述所述的21种双酚类化合物。

本实施例HPLC-MS/MS方法中，色谱柱可采用Agilent ZORBAX SB C18柱(2.1×50mm.i.d.,1.8μm)或ACOUITY UPLC BEH C18柱(2.1×50mm.i.d.,1.7μm)，为更进一步优化实验条件，比较了该两款色谱柱对21种目标物的保留和分离，分别取相同浓度的混合标准溶液，采用上述两种色谱柱分别进行超高效液相色谱实验。其中的两种色谱柱下BFDGE同分异构体的多反应监测离子图如图1所示，从BFDGE同分异构体的多反应监测离子图来看，ACOUITY UPLC BEH C18柱的分离效果更好，因此，本实施例优选的采用ACOUITY UPLC BEH C18柱。

另外，本实施例进一步比较了水-甲醇(H₂O-MeOH)和水-乙睛(H₂O-ACN)的流动相体系，对比了该两种流动相体系对相同浓度的混合标准溶液中目标物的分离的影响。如图2、3所示，图2为两种提取溶剂下目标物的总离子流图，图3为示例性地给出了两种流动相下BFDGE同分异构体的提取离子流图，结果表明，有机相为乙腈时比以甲醇为有机相时质谱响应低，甲醇是质子型溶剂更有助于正扫描模式的离子化，提高了灵敏度；乙腈比甲醇的洗脱能力强，对BFDGE同分异构体的分离也较好，但实际检测中是以BFDGE的总量来定量，因此，本实施例优先选择灵敏度更高的水-甲醇流动相体系。

为考察柱温对各目标物分离情况的影响，本实施例还分别对比了不同柱温，如30℃、40℃、50℃下对各目标物的分离情况，从总离子流图上看不出在保留时间和峰分离上的差别，但是从BFDGE同分异构体的质谱多反应监测(multiple reaction monitoring，简称MRM)图上可以看出温度变化后的细微差别，如图4所示，当温度升到40℃时，BFDGE同分异构体达到了最好的分离状态，因此，本实施例优选40℃作为柱温条件。

为考察提取溶剂对乳制品中双酚类相关化合物的提取能力，本实施例对比分析了不同提取溶剂，如1％乙酸乙腈(v/v)、0.1％乙酸乙腈(v/v)、1％乙酸甲醇(v/v)、0.1％乙酸甲醇(v/v)对牛奶样品中双酚类相关化合物的提取能力的影响。

空白牛奶样品采样于超市，经筛查确定不含双酚类化合物，精密称取的5g空白牛奶样品，加入一定浓度的上述配制好的混合标准工作液，加入一定体积的提取溶剂，加入4gMgSO₄和1.48g乙酸钠，涡旋1min。静置取10mL上清液转移到另一个比色管中，加入1gMgSO₄390mgPSA和190mgC18净化，涡旋1min后取6mL上清液氮吹近干，用1.5mL的甲醇-水(50:50，v/v)复溶，涡旋30s后过0.22μm的滤膜，上机待测。在对比上述四种提取溶剂对双酚类化合物回收率的影响实验中，每种提取溶剂所添加的体积相同，具体实验结构如图5所示。

图5给出了上述各提取溶剂下双酚类化合物的回收率，如图5所示，其中的1％(v/v)HOAC in ACN为1体积的乙腈中含有1％的乙酸，即为1％乙酸乙腈；0.1％(v/v)HOAC in ACN为1体积的乙腈中含有0.1％的乙酸，即为0.1％乙酸乙腈；1％(v/v)HOAC in MeOH为1体积的甲醇中含有1％的乙酸，即为1％乙酸甲醇；0.1％(v/v)HOAC in MeOH为1体积的甲醇中含有0.1％的乙酸，即为0.1％乙酸甲醇。由图5可知，1％乙酸乙腈的提取能力最好，提取几乎所有双酚相关化合物的回收率达到80％以上(BPP、BFDGE-2H2O除外)。因乙腈的沉淀蛋白能力更强，萃取的脂肪等亲脂性成分更少，提取液更干净。因此，本实施例优选采用含有体积分数为1％乙酸的乙腈，即1％的乙酸乙腈作为提取溶剂。

提取溶剂加的越多，提取就越完全，然而提取溶剂加的过多，也会造成试剂的浪费，加大实验成本，因此，本实施例进一步分析了提取溶剂体积对21种目标物的提取的影响进行了分析，以精密称取的5g牛奶为样品，分别考察了6mL、9mL、12mL、15mL、18mL的1％乙酸乙腈(v/v)对双酚类有关化合物回收率的影响，如图6所示，图6给出了，加入不同体积的提取溶剂，对应的双酚类化合物的回收率。从结果来看，溶剂量为15mL时21种目标物基本提取完全，因此，本实施例中在以5g牛奶为样品进行检测分析时，提取溶剂量可优选为15mL。

为进一步提高对样品中目标物的提取率，在目标物提取过程中，硫酸镁的添加量满足硫酸镁与乳制品的质量比为0.6-1:1，乙酸钠(NaAC)的添加量满足NaAC与乳制品的质量比为0.2-0.4:1；在净化上清液的过程中，硫酸镁的添加量满足每毫升上清液加入硫酸镁的质量为6-10mg，N-丙基乙二胺(PSA)的添加量满足每毫升上清液加入PSA的质量为30-40mg，C18的添加量满足每毫升上清液加入15-25mg。

为进一步提高对样品中目标物的提取率，本实施例还采用响应面法优化乙酸钠(NaAC)、N-丙基乙二胺(PSA)及C18的用量，分析乙酸钠(NaAC)、N-丙基乙二胺(PSA)及C18的用量对双酚类化合物回收率的影响，寻找最优的NaAC、PSA及C18的用量。具体为，根据Box-Benhnken实验设计原理，结合单因素实验结果，选取NaAC量、PSA量、C18量三个因素的三个水平，实验因素及水平设计见表1。

表1 Box-Benhnken设计中的因素和水平

采用RSM软件对所得结果数据分析，回归分析结果见表1。对各因素回归拟合后，得到回归方程：Y＝39.02+29.19X₁+0.31X₂+0.12X₃-8.633×10^-3X₁X₂-6.839×10^-3X₁X₃-1.303×10^-4X₂X₃-9.08X₁²-7.348×10^-4X₂²-4.357×10^-4X₃²。其中的以双酚类化合物的回收率的均值为响应变量，以NaAC及PSA的使用量为输入变量，获得的响应面分析的立体图，如图7所示，以PSA及C18的使用量为输入变量，获得的响应面分析的立体图，如图8所示，以NaAC及C18的使用量为输入变量，获得的响应面分析的立体图，如图9所示。

根据图7至9所示，以5g牛奶为样品进行检测分析时，可预测的最优条件为乙酸钠量为1.48mg，PSA量为390mg，C18量为190mg，在此条件下所有双酚类化合物的平均回收率为94.43％。

实施例三

结合实施例二提供的乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法，本实施例提供了乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法的优选实施方式，以牛奶为例，验证本实施例提供的检测方法的可靠性。

对样品进行前处理，精密称取5g牛奶于50mL具塞比色管中，加入15mL的1％乙酸乙腈作为提取溶剂，加入4gMgSO₄和1.48g乙酸钠，涡旋1min。静置取10mL上清液转移到另一个比色管中，加入1gMgSO₄，390mgPSA和190mgC18净化，涡旋1min后取6mL上清液氮吹近干，用1.5mL的甲醇-水(v/v，50:50)复溶，涡旋30s后过0.22μm的滤膜，取过滤后的液体进样至HPLC-MS/MS中检测分析。

制作标准曲线，首先配制单标储备液：分别精密称取各双酚类化合物标品10mg，加适量10ml甲醇溶解并定容，配制成浓度1mg/mL的单标储备液置于棕色玻璃瓶中，-20℃避光密封储存。再配制混合标准工作液：分别取相同体积的各单标储备液10μl置于容量瓶中混合，加适量甲醇-水(v/v，5:5)稀释成0.01mg/mL的中间液，再取适量中间液，加甲醇-水(v/v，5:5)稀释得0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.4μg/ml，0.8μg/ml，1μg/ml浓度的工作液，分别注入HPLC-MS/MS中进行分析，获得标准曲线。

其中的HPLC-MS/MS中的色谱条件为：色谱柱采用ACOUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm.i.d.,1.7μm)；柱温40℃；流动相：A相：水，B相:甲醇；流速：0.2mL/min；进样量：10μL，流动相梯度洗脱程序如表2所示。

表2

其中的HPLC-MS/MS中的质谱条件为：离子源：正离子模式(ESI⁺)和负离子模式(ESI^-)同时扫描，多反应监测模式(MRM)；质量分析器：三重四级杆；干燥气温度：220℃；干燥气流速：14L/min；雾化气压力：20Psi；鞘气温度：300℃；鞘气流量：11L/min；喷嘴电压：1500V；毛细管电压：3000V。21种目标物(双酚类化合物)的质谱参数，如母离子(precursor ions)，子离子(prouduct ions)，碰撞能(collision energy,驻留时间(dwell time)见表3。

表3 双酚类化合物的质谱参数

注：*定量离子。

经HPLC-MS/MS检测分析得到的标准曲线、线性范围、检测限及定量限如表4所示，得到的21种双酚类化合物的回收率和精密度如表5所示。

表4 21种双酚类化合物的标准曲线、定量限和检测限

精密称取的5g空白牛奶样品，加入一定浓度的上述配制好的混合标准工作液，加入一定体积的提取溶剂，加入4gMgSO₄和1.48g乙酸钠，涡旋1min。静置取10mL上清液转移到另一个比色管中，加入1gMgSO₄ 390mgPSA和190mg C18净化，涡旋1min后取6mL上清液氮吹近干，用1.5mL的甲醇-水(v/v，50:50)复溶，涡旋30s后过0.22μm的滤膜，进样至HPLC-MS/MS中检测分析，并计算双酚类化合物的回收率、日内精密度及日间精密度，具体计算结果如表5所示。

表5 双酚类化合物的平均回收率、日内精密度及日间精密度

在三个浓度水平加标下，双酚类化合物回收率在88.3～108.2％之间，RSD均小于15％，表明该方法准确度良好，日内精密度和日间精密度均小于10％，表明方法重复性好，可对双酚类化合物进行定量检测。

依照上述乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法对市场上购买的23例不同品牌的乳制品，如纯牛奶、酸奶、花生牛奶、蜜瓜牛奶、核桃乳等进行筛查，具体检测结果如表6所示，其中n.d.表示未检出，检出有双酚类化合物的样品有7例，该7例中含有的双酚类化合物如表6所示。

表6 样品检测结果

本发明提供的乳制品中双酚类化合物的快速定量检测方法，其采用HPLC-MS/MS法，能同时利用液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度鉴定能力对乳制品中的多种双酚类化合物进行分离和鉴定，分离效率高，鉴定准确；可将21种双酚类化合物进行分离定性及定量，且提取的双酚类化合物的回收率较高，可有效地用于乳制品中双酚类化合物的筛选。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。