本发明属于烟草制品生物学效应评价技术领域，特别涉及一种检测口含烟制品对细胞过氧化氢酶酶活力影响的方法。
背景技术：
随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟制品和不含烟叶原料的新型口含烟制品(如烟草含片)。口含烟研发人员在产品配方设计初期将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试指标对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，无统一的标准方法。
机体在遭受各种不利刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。过氧化氢(H2O2)是活性氧自由基中的重要一种，过氧化氢酶(CAT)能够催化过氧化氢分解成氧和水，对其进行测定，可用于产品初选配方的进一步筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测口含烟制品对细胞过氧化氢酶酶活力影响的方法，为电子烟制品的安全性评估提供参考。
本发明公开一种检测口含烟制品对细胞过氧化氢酶酶活力影响的方法，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种；
(5)受试物的分组；
(6)受试物检测剂量的设定；
(7)受试物培养品的制备；
(8)受试物的孵育；
(9)受试物孵育品的收集；
(10)受试物孵育品的裂解离心；
(11)标准曲线的测定；
(12)受试物孵育品的测定；
(13)蛋白浓度测定；
(14)过氧化氢酶酶活力计算。
本发明优选的实施方案中，上述的方法，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37℃下静置24h，萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备：人口腔角质细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人口腔角质细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人口腔角质细胞单细胞悬浮液加入OKM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为4mL/皿，接种到直径为60mm细胞培养皿中，将细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞；检测样品组为在OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5个非零剂量：12.5％样品萃取液、25％样品萃取液、50％样品萃取液、75％样品萃取液、100％样品萃取液；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中直径为60mm细胞培养皿内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞；检测样品组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；用OKM细胞培养基将每孔液体体积补足至4mL；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的直径为60mm细胞培养皿置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；
(9)受试物孵育品的收集：去除步骤(8)中的培养基，用磷酸盐缓冲液洗一遍，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维细胞培养液悬起，1000rpm低温离心10min；
(10)受试物孵育品的裂解离心：收集步骤(9)得到的细胞，加入100μL细胞裂解液，冰浴裂解，裂解后收集细胞，1600rpm低温离心10min，取上清液待后续测定；
(11)标准曲线的测定：取0、12.5、25、50、75μL配制好的5mmol/L过氧化氢溶液至1.5mL离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液稀释至最后体积为100μL混匀，各取4μL加入96孔板，加入200μL配制好的显色液，25℃孵育至少15min后酶标仪测定520nm处吸光度；；
(12)受试物孵育品的测定：在不同离心管内加入40μL样品待测液，空白对照组加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液；随后分别加入10μL的250mmol/L过氧化氢溶液，迅速混匀，25℃反应5min；加入450μL过氧化氢酶反应终止液振荡混匀终止反应；在塑料离心管内加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀，从中取最终反应体系液体10μL加入96孔板，再加入200μL配制好的显色工作液。25℃孵育15min后测定A520；
(13)蛋白浓度测定：测定样品蛋白浓度；
(14)过氧化氢酶酶活力计算：
a.根据步骤(11)测定的标准溶液吸光度值绘制标准曲线：
A520＝k[过氧化氢微摩尔数]+b，由标准曲线计算出k和b的值；
b.计算出样品中残余的过氧化氢摩尔数：
残余过氧化氢微摩尔数＝(A520-b)/k
c.过氧化氢酶酶活力计算：
[样品过氧化氢酶酶活力]＝([空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数])×[稀释倍数]/(5min×40μL×[蛋白浓度])。
本发明优选的实施方案中，步骤(5)中所述的OKM细胞为Oral Keratinocyte Medium细胞。
本发明优选的实施方案中，步骤(10)所述的细胞裂解液购买于碧云天公司，是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。
本发明有益效果：
本发明对口含烟制品对细胞过氧化氢酶酶活力影响进行了综合研究，确定了口含烟制品的检测剂量，以及口含烟制品前处理方法，制定了一种适用于检测口含烟制品对细胞过氧化氢酶酶活力影响的方法。
本发明对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测口含烟制品对细胞过氧化氢酶酶活力影响的方法。
具体实施方式
下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
本发明针对2种国外市售口含烟制品对人口腔角质过氧化氢酶酶活力影响的方法。
(1)受试物的前处理：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37℃下静置24h，萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备：人口腔角质细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人口腔角质细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人口腔角质细胞单细胞悬浮液加入OKM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为4mL/皿，接种到60mm细胞培养皿中，将细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞；检测样品组为在OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5个非零剂量：12.5％样品萃取液、25％样品萃取液、50％样品萃取液、75％样品萃取液、100％样品萃取液；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中直径为60mm细胞培养皿内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞；检测样品组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；用OKM细胞培养基将每孔液体体积补足至4mL；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的直径为60mm细胞培养皿置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；
(9)受试物孵育品的收集：去除步骤(8)中的培养基，用磷酸盐缓冲液洗一遍，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维细胞培养液悬起，1000rpm低温离心10min；
(10)受试物孵育品的裂解离心：收集步骤(9)得到的细胞，加入100μL细胞裂解液，冰浴裂解，裂解后收集细胞，1600rpm低温离心10min，取上清液待后续测定；
(11)标准曲线的测定：取0、12.5、25、50、75μL配制好的5mmol/L过氧化氢溶液至1.5mL离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液稀释至最后体积为100μL混匀，各取4μL加入96孔板，加入200μL配制好的显色液，25℃孵育至少15min后酶标仪测定520nm处吸光度；；
(12)受试物孵育品的测定：在不同离心管内加入40μL样品待测液，空白对照组加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液；随后分别加入10μL的250mmol/L过氧化氢溶液，迅速混匀，25℃反应5min；加入450μL过氧化氢酶反应终止液振荡混匀终止反应；在塑料离心管内加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀，从中取最终反应体系液体10μL加入96孔板，再加入200μL配制好的显色工作液。25℃孵育15min后测定520nm处的吸光度A520；
(13)蛋白浓度测定：测定样品蛋白浓度；
(14)过氧化氢酶酶活力计算：
a.根据步骤(11)测定的标准溶液吸光度值绘制标准曲线：
A520＝k[过氧化氢微摩尔数]+b，由标准曲线计算出k和b的值；
b.计算出样品中残余的过氧化氢摩尔数：
残余过氧化氢微摩尔数＝(A520-b)/k
c.过氧化氢酶酶活力计算：
[样品过氧化氢酶酶活力]＝([空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数])×[稀释倍数]/(5min×40μL×[蛋白浓度])。
表1 2种口含烟制品对人成纤维细胞HOK过氧化氢酶酶活性的影响
由试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测剂量条件下，样品1#、2#在检测剂量范围内对HOK细胞的过氧化氢酶酶活性存在影响，且有剂量效应关系，与0剂量组相比存在显著差异(p<0.05)；样品1#在检测剂量范围内与样品2#相比存在显著差异(p<0.05)；以上结果显示，不同的口含烟对HOK细胞的过氧化氢酶酶活性的影响存在差异。