本发明属于医药技术领域，涉及运用高效液相色谱串联三重四级杆质谱快速测定盾叶薯蓣中原薯蓣皂苷含量的方法。
背景技术：
盾叶薯蓣俗称黄姜、火头根，为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）植物盾叶薯蓣Dioscorea zingiberensis C. H. Wright的根状茎横生，近圆柱形。以根状茎入药，甘、苦、平。解毒消肿，用于痈疖早期未破溃，皮肤急性化脓性感染，软组织损伤，蜂螫虫咬。盾叶薯蓣根茎富含皂苷类成分，因其组分复杂，且分离过程难度较大，难以定量，目前只能以总皂苷经酸水解，得到薯蓣皂苷元的含量为测定指标来控制盾叶薯蓣的质量。近代药理学研究表明，盾叶薯蓣总皂苷有抗肿瘤、抗血栓形成、抗过敏、抗病毒和抗休克作用。而盾叶薯蓣中原薯蓣皂苷的含量影响其质量和作用效果。目前，原薯蓣皂苷的含量测定多为HPLC法，提取方法复杂，费时，且其仅在近200nm处有较弱的紫外吸收，易产生干扰。对盾叶薯蓣中原薯蓣皂苷定性及快速定量方法尚未见报道。
本发明采用MRM方法，解决了甾体皂苷类化合物没有共轭结构，吸收波长处于紫外末端吸收，以往HPLC检测基线不稳，灵敏度较低，不易测定的问题。同时，盾叶薯蓣根茎中化学成分复杂，且皂苷化学结构比较相近，极性较大，HPLC法测定需采用长时间的梯度洗脱程序。本方法对待测成分的分离要求不高，因此大大缩减了洗脱时间，简化了操作步骤，为盾叶薯蓣的成分分析、质量评价提供指导意义和科学基础。
技术实现要素：
本发明建立了HPLC-QqQ-MS法，以甘草次酸为对照，采用多级反应监测（MRM）法，测定盾叶薯蓣中原薯蓣皂苷的含量。它是采用SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18（150 mm×4.6 m，5μm）色谱柱，流动相：乙腈：水（70：30），等度洗脱：8min；进样量：10μL；柱温：40℃；流速0.5mL/min；扫描方式为多级反应监测（MRM）模式，离子源为ESI（Turbo Spray）源，负离子化方式检测，离子源电压为5.5kV；加热毛细管温度为400℃；CAD为5；帘气为10；Gas1为45；Gas2为45；去簇电压为-114V。用于定量分析的离子反应为m/z 1047.6→901.4（原薯蓣皂苷）、m/z 469.3→425.3（外标甘草次酸）。结果：采用液质联用法测得, 原薯蓣皂苷质量浓度在8.8～66μg·mL-1内，线性关系良好，R2=0.9993，平均加样回收率为93.4%。结论: 所建立方法快速、简便、准确、重现性好，可用于盾叶薯蓣提取物质量控制。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种测定盾叶薯蓣中原薯蓣皂苷含量的方法，其特征在于采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱法，快速测定盾叶薯蓣中原薯蓣皂苷的含量，按如下步骤进行：
（1）对照品、内标溶液制备：称取原薯蓣皂苷对照品及甘草次酸对照品各5.0mg分别置于5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的储备液，4℃保存备用；
（2）供试品溶液制备： 取盾叶薯蓣干燥根茎粉末1g精密称定。加入甲醇25mL, 超声波处理30min后离心。上清液过微孔滤膜, 滤液即HPLC-MS/MS法测定用的供试溶液；
（3）测定：分别精密吸取步骤（1）得到的对照品溶液各10μL，步骤（2）提取的供试品溶液10μL，注入HPLC-MS/MS联用仪，测定。多级反应检测模式进行扫描，锁定原薯蓣皂苷结构，用外标法计算原薯蓣皂苷含量。
本发明中，更加详细的制备方法及测定方法如下：
1.仪器与试药
1.1仪器 LC-20AD液相色谱系统，配备SIL-20AC自动进样系统和CTO-20A柱温箱（日本岛津公司）；API 4000 三重四级杆检测器，操作软件为Analyst 1.5.1（美国应用生物系统有限公司）；AL104-1C万分之一电子天平(瑞士Mettler Tolido公司)；AB 135-S十万分之一电子天平（瑞士Mettler Tolido公司）；KQ－100DE型数控超声波清洗器（昆山市超市仪器有限公司）； Direct-Q3纯水机 (美国Millipore)。
1.2试药 对照品原薯蓣皂苷（批号：1-0422-50） 购于北京欣荣科技有限公司 纯度>98% 对照品甘草次酸（批号：Z110723）购于上海源叶生物科技有限公司 纯度>98% 乙腈、甲醇为（色谱纯，TEDIA） 超纯水经Milli-Q系统纯化制备。
2.方法与结果
2.1色谱及质谱条件 色谱柱：SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18柱（日本岛津公司产品，规格：150 mm×4.6 mm，柱内径：5μm）。流动相：乙腈：水（70：30），等度洗脱：8min。进样量：10μL；柱温：40℃；流速0.5mL/min。扫描方式为多级反应监测（MRM）模式，离子源ESI（Turbo Spray）源，负离子化方式检测，离子源电压为5.5kV；加热毛细管温度为400℃；CAD为5；帘气为10；Gas1为45；Gas2为45；去簇电压为-114V。待测成分和内标离子对质量数及碰撞能量优化结果见表1。
表1 原薯蓣皂苷及外标的MRM参数
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备：差量法精密称取原薯蓣皂苷对照品及甘草次酸对照品各5.0mg分别置于5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的储备液，4℃保存备用。
2.2.2供试品溶液的制备：取盾叶薯蓣干燥根茎粉末1g精密称定。加入甲醇25mL, 42kHz超声波处理30min, 5000r·min-1离心5min。上清液过0.45μm微孔滤膜滤过, 滤液即为HPLC-MS/MS法测定用的供试溶液。
2.3方法学考察
2.3.1线性范围考察精密吸取原薯蓣皂苷对照品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至各浓度（分别为8.8，17.6，33.0，35.2，66.0μg·mL-1)。精密吸取各个浓度10μL, 依次进样,以进样浓度(μg·mL-1)为横坐标, 待测品色谱峰面积与内标峰面积比值为纵坐标, 绘制标准曲线, 原薯蓣皂苷回归方程见表2。
表2 原薯蓣皂苷的线性考察
结果表明，原薯蓣皂苷回归方程线性关系良好，线性范围为9～66μg·mL-1。
2.3.2定量限和检测限的测定取2.2.1项下原薯蓣皂苷对照品溶液1 mL，逐级稀释，并依次进样10 μL，以S/N=3求得各个组分的检测限，以S/N=10求得各个组分的定量限，结果见见表2。
2.3.3 精密度试验取2.2.2项下样品，连续进样6次，测定峰面积平均值，计算精密度RSD值。
2.3.4 重复性 称取盾叶薯蓣药材粉末6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算含量平均值及RSD值。
2.3.5 稳定性 取2.2.2项下制得的供试品溶液，置4℃冰箱存放。分别于0，6，12，18，24 h进样分析，测定峰面积，计算稳定性RSD值。
2.3.6 加样回收率考察 精密称取盾叶薯蓣药材粉末6份，加入对照品原薯蓣皂苷3.2mg，按2.2.2项下方法制备溶液，进样分析，计算回收率为93.4%，RSD为2.0%。
2.4 样品测定 按1.2项下对样品进行含量测定，MRM质谱图见图1。按外标法计算原薯蓣皂苷的含量，结果见表3。
表3 原薯蓣皂苷含量测定
3. 流动相及质谱检测方法选择：
3.1皂苷类成分极性偏大，因此本实验考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－酸水和乙腈－酸水不同的溶剂系统，以及60%，70%，80%，90%四种比例等度洗脱 及梯度洗脱。结果表明80%乙腈－水系统的分离效果较好，使得峰形良好，且出峰时间适中，相对于梯度洗脱更稳定、简便。因此本实验选择梯80%乙腈－水系统度洗脱方式。
3.2 本实验采用MRM方法，解决了甾体皂苷类化合物没有共轭结构，吸收波长处于紫外末端吸收，以往HPLC检测基线不稳，灵敏度较低，不易测定的问题。同时，盾叶薯蓣根茎中化学成分复杂，且皂苷化学结构比较相近，极性较大，HPLC法测定需采用长时间的梯度洗脱程序。本方法对待测成分的分离要求不高，因此大大缩减了洗脱时间，简化了操作步骤。
本发明公开的测定盾叶薯蓣中原薯蓣皂苷含量方法的优点在于：
（1）经摸索建立了原薯蓣皂苷的高效液相色谱串联二级质谱（HPLC-QqQ-MS）测定法。研究表明，选用此方法，解决了甾体皂苷类化合物没有共轭结构，吸收波长处于紫外末端吸收，以往HPLC检测基线不稳，灵敏度较低，不易测定的问题。
（2）经方法学考察证明，本方法操作简便、准确，重现性好，可用于盾叶薯蓣的成分分析及质量评价。