一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒的制作方法

本发明属于兽医生物
技术领域：
，具体涉及一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，能用于猪萨佩罗病毒抗体检测及猪萨佩罗病毒感染的判断。
背景技术：
：猪萨佩罗病毒(PorcineSapelovirus,PSV)可引起猪脑脊髓灰质炎、肺炎、繁殖障碍、心包炎、心肌炎、皮肤损伤、腹泻等多系统综合征。PSV能在猪肠道上皮细胞繁殖，并随粪便排出体外，感染猪只康复后依然会继续排毒，使该病毒在环境中大量存在，成为重要的病毒传染源。PSV还能和猪流行性腹泻、猪瘟、猪蓝耳病、猪细小等常见猪疫病病原相互作用，加重该些病的危害。PSV的实验室诊断方法主要包括病理组织学检测、病毒的分离与鉴定、RT-PCR等，但这些方法主要用于检测病原，且对试验条件和技术要求较高，不适合高通量检测。目前还没有关于猪萨佩罗病毒抗体检测方法的报道，本发明利用分子生物学基因克隆表达技术，获得PSV病毒VP1重组蛋白，以其作为抗原首次建立检测PSV抗体的ELISA方法并组装成试剂盒，可对目前我国流行的PSV病毒进行有效的血清学诊断和调查，判断猪群中PSV抗体水平和自然感染的状况，为PSV病毒的防制提供一种快速、简便的检测方法。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种快速、准确、简便、适于大批量检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，以便于猪萨佩罗病毒感染的诊断及流行病学调查。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其特点是，所述试剂盒内含有猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白。所述猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白为纯化的利用重组原核表达载体质粒pET-28a-VP1表达的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。所述试剂盒内设有猪萨佩罗病毒抗体检测板条，该检测板条为包被猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白的96孔酶标板。所述试剂盒内还设有阴性对照血清、阳性对照血清、血清稀释液、酶标二抗、洗涤液、底物显色液及终止液。其中，所述阴性对照血清为没有感染猪萨佩罗病毒的健康猪血清，阳性血清为接种猪萨佩罗病毒后采集的猪血清；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG。本发明的试剂盒，能用于PSV抗体检测，弥补了PSV抗体检测方法的空白；具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简单的特点，易于基层推广。附图说明图1是PSVVP1基因的PCR产物电泳图。其中，1为阴性对照；2为VP1基因扩增产物；M为DNA分子量标准。图2是PSV重组VP1蛋白的表达电泳图。其中，M为蛋白分子量标准；1为阴性对照菌全菌；2为重组表达菌上清；3为重组表达菌沉淀。图3是纯化的PSV重组VP1蛋白的电泳图。其中，1为纯化的重组VP1蛋白；M为蛋白分子量标准。具体实施方式实施例1PSV重组VP1蛋白的制备1)猪萨佩罗病毒RNA提取及反转录：用病毒RNA提取试剂盒(北京天恩泽公司),按说明书操作从组织病料中提取猪萨佩罗病毒RNA。以所提取的RNA为模板,用反转录试剂盒(美国Theremo公司),按说明书操作获得cDNA。2)猪萨佩罗病毒VP1基因的克隆：根据GenBank中猪萨佩罗病毒的基因序列(登录号：KX354740)设计两条引物，上游引物(Fp)为：CGCGGATCCGGGGATATAAAAGAAGTGGTGCA(SEQIDNo:2)；下游引物(Rp)为：CCCAAGCTTCTATTGAGTTGCAGGGTAATATCT(SEQIDNo:3)，两引物序列中下划线分别表示BamHI和HindIII酶切位点，以上述反转录成的cDNA为模板，通过PCR方法扩增VP1基因。PCR体系含10μL5×Buffer、4μLdNTP、1μLFp、1μLRp、1μL高保真DNA聚合酶、2μL模板及23μL灭菌超纯水；PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环。反应完后取6μLPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增片段经电泳检测，结果见图1，扩增片段大小与预期目的片段大小相符。3)重组表达质粒的构建：将扩增的PCR产物和和pET28-a(+)载体分别经BamHI和HindIII酶切,37℃恒温箱中反应2h，回收各自的酶切片段，用T4DNA连接酶连接，连接体系为：1μL载体酶切产物、7μL目的基因酶切产物、1μL10×T4连接Buffer及1μLT4连接酶，将配好的体系置于16℃水浴中12h。将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态中，提取质粒，酶切鉴定阳性克隆，将鉴定为阳性克隆的质粒送华大公司基因公司进行序列测定。测序结果表明VP1基因片段已于BamHI和HindIII酶切位点之间与pET-28a(+)载体正确相连，表达蛋白的阅读框正确，说明重组原核表达载体质粒pET28a-VP1构建成功。4)重组蛋白的表达：将pET28a-VP1重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，转化过程为：取5ul连接产物，加入到100ul上述大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min，42℃热冲击90s，再冰浴2min，于超净工作台中加入700ulLB培养基，于37℃180rmp/min摇床中摇菌45min后3000rmp离心3min，留100ul上清重悬菌泥，取菌液涂布于含卡那霉素30μg/mL的LB琼脂平板上，置于37℃恒温箱中培养24h后，挑取单克隆菌落，参照Novagen公司pETSyetemManual表达重组VP1融合蛋白，并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白，显示重组VP1蛋白主要以包涵体形式表达(图2),其氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。5)重组蛋白的纯化：使用His标签蛋白纯化试剂盒(Novagen公司产品)，参照使用说明书，对重组VP1蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE电泳检测，见图3，结果表明重组VP1蛋白获得纯化。实施例2检测PSV抗体的ELISA试剂盒的制备1)抗体检测板条：每个试剂盒包含2块ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA板条，规格为8孔×12条。ELISA板条(抗原板)的制备：用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释实施例1中得到的纯化的VP1融合蛋白，用方阵法确定最佳包被浓度为2.5μg/ml，取可拆96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃包被24小时后用含0.05％吐温-20(体积比)的PBS(pH7.4)洗涤液(PBST)洗涤2次，用5％脱脂奶粉(质量体积比)37℃封闭1小时，用PBST充分洗涤，室温风干。2)阴、阳性对照血清(各1.5mL)：阴性血清为没有感染PSV的健康猪血清，阳性血清为接种PSV病毒后采集的猪血清。3)血清稀释液(60mL)：1％BSA，由10g牛血清白蛋白BSA加800mLPBST溶解，加灭菌水至1000mL配制成。4)酶标二抗(30mL)：将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG用含1％BSA的PBST稀释10000倍，做为直接使用浓度的酶标二抗。5)洗涤液(75mL)：10倍浓缩的含0.5％吐温-20的1MPBS(pH7.4)。6)底物显色液(15mL)：以双蒸水定容至1000ml，配置显色液A。称取9.33g柠檬酸、14.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、6.4ml0.75％过氧化氢尿素，混匀，调pH值到5.0-5.4，加双蒸水定容至1000ml，配制显色液B。显色液A、B等体积混合，即为底物显色液。7)终止液(15mL)：2MH2SO4。实施例3PSV抗体检测试剂盒的使用a.将待检血清样品用血清稀释液100倍稀释后，取100μl加至抗体检测板，阳性和阴性对照血清不用稀释，直接加100μl，且重复两孔，置37℃孵育30分钟后弃去孔内液体，每孔用250-300μl洗涤液洗涤4次。b.每孔加入100μl的酶标二抗,将酶标板置于37℃孵育30分钟后弃去孔内液体，每孔用250-300μl洗涤液洗涤4次。c.加入底物显色液，每孔50μl，37℃避光显色15分钟。d.加入终止液，每孔50μl，终止显色。e.用酶标仪在450nm波长下读取OD值，并计算样品的S/P值，S/P值＝(样品OD450值―阴性对照平均OD450值)/(阳性对照平均OD450值―阴性对照平均OD450值)。根据判定标准确定待检样品的阴、阳性结果。PSV抗体检测试剂盒的判定标准：用PSV抗体检测试剂盒检测40份阴性血清，计算其平均S/P值(X)为0.183，标准差(SD)为0.039,根据统计学原理，确定阴、阳性结果的临界值＝X+3SD＝0.3，即当S/P≥0.3，样品为抗PSV抗体阳性，当S/P＜0.3，样品为抗PSV抗体阴性。实施例4应用本试剂盒对临床样品进行抗体检测应用本发明的PSV抗体检测试剂盒对来自湖南省8个猪场的368份临床猪血清样品进行检测，结果见表1。该检测结果显示临床上A～H8个猪场的抗体阳性率在29.17％～62.50％之间，平均抗体阳性率52.17％，表明本试剂盒能用于大批量PSV抗体的快速检测。表1A-H猪场血清样品检测结果猪场检测样品数(份)阳性数(份)阳性率A241145.83％B24729.17％C482756.25％D401537.50％E482245.83％F402562.50％G482654.17％H965961.46％共计36819252.17％SEQUENCELISTING<110>湖南农业大学；湖南康保特生物科技有限公司<120>一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>318<212>PRT<213>合成<400>1MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ArgGlySerHisMetAlaSerMetThrGlyGlyGlnGlnMetGlyArg202530GlySerGlyAspIleLysGluValValGlnAlaHisIleAsnAsnThr354045LeuGlnSerAlaLeuThrThrArgProGlnGlnGluGlnValSerAsn505560GlyIleMetIleAsnGlnGlyAspAlaProAlaLeuGlyAlaAlaGlu65707580ThrGlyGluSerAspThrAsnSerGlyGlySerThrMetGluLeuGln859095AlaThrAsnCysValPheSerLeuArgGluThrAspLeuGluTyrLeu100105110MetSerArgTyrSerLeuMetTyrGluAspIleLeuAspTyrThrSer115120125SerThrGlyArgArgHisLeuValTyrAsnValAspPheArgThrIle130135140GlyLysSerGlySerAspIleThrLysPheArgAlaPheThrTyrTrp145150155160ArgPheAspLeuAspValValValMetMetLeuGluAspLysAlaSer165170175LysValSerAsnValMetPheGlnValLeuPheThrProHisGlyGly180185190AlaValProGlyThrHisAsnThrAlaIleTrpAsnAlaProAsnSer195200205ThrSerIleTyrThrArgValGlyAsnAlaProAlaSerPheArgIle210215220ProPheMetSerValCysAsnTyrTyrThrSerPheTyrAspGlyAsp225230235240GlyAsnPheAspArgAsnGlyAlaSerTyrGlyIleAsnProGlyAsn245250255PheIleGlyThrIleSerIleArgMetAlaAsnAspPheGlnThrAsp260265270AlaThrThrGlyAlaPheArgAlaLysIlePheLeuArgProValAsn275280285IleGluAlaTyrMetProArgProLeuIleSerTyrLysAlaAsnGly290295300ThrAlaArgGluAspSerSerArgTyrTyrProAlaThrGln305310315<210>2<211>32<212>DNA<213>人工合成<400>2cgcggatccggggatataaaagaagtggtgca32<210>3<211>33<212>DNA<213>人工合成<400>3cccaagcttctattgagttgcagggtaatatct33当前第1页1 2 3