本发明涉及生物医药领域，特别涉及结核分枝杆菌蛋白在制备诊断结核潜伏感染者和/或活动性肺结核产品中的用途。
背景技术：
由结核分枝杆菌引起的结核病仍然是严重威胁人类健康的疾病之一，根据世界卫生组织最新报告，2015年全球新发结核病病例为1040万人，约180万人死于结核病，中国的新发病人数为91.8万人，死亡人数为3.8万人，发病总人数位居世界第四位。无论是在全球还是在中国，结核病的防治工作仍然是任重道远，特别是在卫生状况较差的一些不发达国家，结核菌的感染率仍然很高。
人体感染结核分枝杆菌后，大约只有10％的人发展为活动性结核病，而90％的人不发病，但体内的结核菌并没有被彻底清除，而是在人体中潜伏下来，称为结核潜伏感染，这些人没有任何临床症状，大多数人在其一生中不发病，仅有5％--10％的人在机体免疫力下降时，会导致结核病的发生。目前全世界约有1/3的人感染了结核菌，可见潜伏感染者人数众多，因此有必要对潜伏感染者进行监控，在感染状态发生变化时及时的给予药物治疗，做到早发现，早治疗，这不仅能够防止病情的恶化，减少治疗的时间和用药治疗引起的副作用，还能减少结核病的播散。因此，结核菌感染后的两种状态的检测和鉴别对结核病的预防和治疗有非常重要的作用。
目前结核菌感染的检测方法有许多种，结核菌素皮肤试验(TST)、γ－干扰素释放试验(IGRA)、传统的痰抗酸菌涂片、分枝杆菌快速培养、结核特异性核酸片断扩增(定量与定性)等。TST是皮肤变态反应，使用时间悠久，主要用于门诊筛查，虽然试验简便易行，但检测结核菌感染的情况时，卡介苗接种会出现相同的结果，无法鉴别自然感染，特异性不强，此外也无法鉴别结核潜伏感染和活动性结核。γ－干扰素释放试验(IGRA)主要是检测细胞免疫反应，虽然能排除卡介苗接种的影响，同样也不能区分潜伏感染者和活动性结核病人，更无法鉴别治疗后的病人和现症感染者。而传统的痰抗酸菌涂片、分枝杆菌快速培养等主要用来检测活动性结核病人，对于潜伏感染状态的判断没有意义，此外对于临床症状不典型的活动性结核患者，可能无法找到细菌学证据。因此寻找一种能够准确鉴别潜伏感染和活动性结核的方法具有重大价值。
基于结核菌感染后引起的宿主保护性免疫反应不同，寻找血清标志物用来区分潜伏感染和活动性结核具有很好的应用前景。抗原抗体反应的血清学诊断方法，由于其简便性、快捷性，标本易于获得，而备受关注，现在已有一些结核分枝杆菌的特异性抗原被用于结核菌感染的血清学诊断，比如分泌性蛋白抗原：抗原85复合体抗原，即Ag85A、Ag85B和Ag85C，等；脂蛋白类抗原：16kDa，27kDa，38kDa抗原等；糖脂类抗原：脂阿拉伯甘露聚糖抗原，结核菌糖类脂抗原等；但是在实际使用中这些抗原均存在阳性检出率低，与其它分支杆菌存在交叉免疫性等问题，虽然在高危人群普查、治疗效果监测、判断预后和提示复发中具有一定的价值，但目前仍不能用于潜伏性结核分枝杆菌感染的确诊。
因此，寻找一种新的能够准确诊断结核潜伏性感染者和活动性结核病病人的方法及标志物极为重要。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中鉴别诊断结核潜伏感染者和/或活动性肺结核的产品存在阳性检出率低，无法鉴别诊断出潜伏性结核分枝杆菌感染的问题，提供了一种结核分枝杆菌蛋白在制备诊断结核潜伏感染者和/或活动性肺结核产品中的用途。
为了解决上述技术问题，本发明一方面提供的技术方案为：
检测样本中抗Rv0284抗体、抗Rv2002抗体和/或抗Rv2421c抗体水平的产品在制备鉴别、诊断和/或筛查结核潜伏感染和/或活动性肺结核产品中的用途。
在本发明的技术方案中，可以使用任意检测样本中抗Rv0284抗体、抗Rv2002抗体和/或抗Rv2421c抗体水平的产品用于制备鉴别、诊断和/或筛查结核潜伏感染和/或活动性肺结核的产品。
作为优选，上述检测样本中抗Rv0284抗体、抗Rv2002抗体和/或抗Rv2421c抗体水平的产品中包含Rv0284蛋白、Rv2002蛋白和/或Rv2421c蛋白。
更优选地，所述Rv0284蛋白为SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.1所示蛋白具有相同功能的蛋白质；所述Rv2002蛋白为SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.2所示蛋白具有相同功能的蛋白质；所述Rv2421c蛋白为SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.3所示蛋白具有相同功能的蛋白质。
以上所述术语“改造”可以使用任意现有技术中对蛋白质的改造方法，包括但不限于，对氨基酸残基的取代和/或添加和/或缺失，从而形成原有蛋白质的衍生物。
作为优选，所述检测可以为现有技术中任意合适的检测方法，但作为优选，所述检测的方法可以为酶联免疫吸附试验、凝集实验、沉淀实验、E花环实验、小吞噬实验、免疫荧光实验、胶体金免疫层析实验、斑点金免疫渗滤实验和/或电化学发光实验。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述检测的方法为酶联免疫吸附试验。
作为优选，所述样本可以为从被检测对象获取的任意合适的样本。但作为优选，所述样本包括血清、血浆、唾液、尿液、胸腹水和/或脑脊液。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述样本为血清。
本发明的另一个方面是提供了一种用于鉴别、诊断和/或筛查结核潜伏感染和/或活动性肺结核的标志物组合物，所述标志物组合物由抗Rv0284抗体、抗Rv2002抗体和/或抗Rv2421c抗体组成；
其中，所述Rv0284为SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.1所示蛋白具有相同功能的蛋白质；所述Rv2002为SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.2所示蛋白具有相同功能的蛋白质；所述Rv2421c为SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.3所示蛋白具有相同功能的蛋白质。
本发明的另一个方面是提供了一种上述标志物组合物在制备鉴别、诊断和/或筛查结核潜伏感染和/或活动性肺结核产品中的用途。
本发明的另一个方面是提供了一种用于鉴别、诊断和/或筛查结核潜伏感染和/或活动性肺结核的试剂盒，所述试剂盒包含Rv0284蛋白、Rv2002蛋白和/或Rv2421c蛋白。
作为优选，所述Rv0284蛋白为SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.1所示蛋白具有相同功能的蛋白质；所述Rv2002蛋白为SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.2所示蛋白具有相同功能的蛋白质；所述Rv2421c蛋白为SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基经改造后与SEQ ID NO.3所示蛋白具有相同功能的蛋白质。
上述试剂盒中包含的Rv0284蛋白、Rv2002蛋白和/或Rv2421c蛋白可以为任意形式，包括但不限于直接的蛋白质样品，以及将蛋白质固定于某种载体，如检测芯片的形式。
除了Rv0284蛋白、Rv2002蛋白和/或Rv2421c蛋白以外，所述试剂盒至少还包括试剂盒说明书。
所述说明书中记载结果的判定标准：使用三种蛋白联合检测，若待测样品的检测结果中，抗Rv0284抗体、抗Rv2002抗体和/或抗Rv2421c抗体中，至少有2种抗体呈阳性，则判定该待测样品是活动性结核阳性，否则为结核潜伏感染。
本发明的另一个方面是提供了一种上述试剂盒在制备鉴别、诊断和/或筛查结核潜伏感染和/或活动性肺结核产品中的用途。
本发明的有益效果为：
本发明可以同时检测三个不同结核分枝杆菌蛋白血清抗体应答的水平，从而可以更好地鉴别诊断结核潜伏性感染者及活动性结核病病人，灵敏度更高，特异性更好。
附图说明
图1为ELISA检测结核潜伏性感染者(n＝93)和活动性结核病病人(n＝92)血清中抗Rv0284抗体、抗Rv2002抗体和抗Rv2421c抗体表达水平的统计图；
图2为联合检测三个抗原对应的抗体的ROC曲线图；
序列说明
SEQ ID NO.1为本发明实施例中的Rv0284蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2为本发明实施例中的Rv2002蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO.3为本发明实施例中的Rv2421c蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明公开了一种检测样本中抗Rv0284抗体、抗Rv2002抗体和/或抗Rv2421c抗体水平的产品在制备鉴别、诊断和/或筛查结核潜伏感染和/或活动性肺结核产品中的用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：样本的收集和处理
本发明检测的样本为血清，收集方法为空腹采集受试者血液，使用不加抗凝剂的普通生化试管，室温静置待自然凝固后，以3000转每分钟常温离心10分钟，收集血清分装于冻存管，放置于-80摄氏度低温冰箱保存，待实验时使用。
本发明使用的样本分为两组：潜伏感染组和活动性结核病人组；其中，潜伏感染组是指无临床主诉症状，TST实验和T-SPOT实验均为阳性，胸部X线片阴性者；活动性结核病人组是指经涂片或培养阳性，未开始或刚开始系统化学药物治疗的确诊结核病人；两组人群均排除糖尿病，HIV感染和其他自身免疫性疾病。
本发明使用的潜伏感染组标本来自北京市结核病胸部肿瘤研究所流行病学研究室流行病学调查项目，活动性结核病人组标本来自首都医科大学附属北京胸科医院结核科各病区住院病人，本课题已获得首都医科大学附属北京胸科医院科研伦理委员会的批准，所有研究对象均知情同意。
实施例2：利用ELISA实验对样本的检测
1.建立ELSIA实验所需的各种缓冲液、稀释液、反应液和终止液：
(1)包被缓冲液(pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)：
Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g加双蒸水至1000ml，调pH至9.6；
(2)pH7.4的PBS溶液：
NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，
加双蒸水至1000ml，调pH至7.4；
(3)pH7.4的PBST洗涤液：
1000mlPBS溶液中加入Tween-20 0.5ml，调pH至7.4；
(4)封闭液(含脱脂奶粉的pH7.4的PBS溶液)：
5g脱脂奶粉加入100mlPBS溶液中；
(5)底物缓冲液：0.2M NaH2PO4(28.4g/L)25.7ml，
0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3ml，加蒸馏水50ml。
(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(pH5.5)10ml 0.75％H2O2 32μl；
(7)终止液(2M H2SO4)：21.32ml H2SO4，178.68ml H2O。
(8)二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgG；
(9)96孔酶标板；Nunc Incorporated(Theromo,Gebenhagen,Denmark)
2.检测步骤：
(1)包被：Rv0284、Rv2002和Rv2421c抗原分别溶解于包被缓冲液中(5ug/ml)；以100ul/孔加入96孔酶标板中，4℃过夜；
(2)洗板：PBST洗涤液300ul/孔，3min，洗3次；
(3)封闭：封闭液，300ul/孔，室温孵育1h；
(4)洗板：洗涤液300ul/孔，3min，洗3次；
(5)加血清：按1:400稀释后的待测血清，100ul/孔，室温孵育1h；
(6)洗板：洗涤液300ul/孔，3min，洗5次；
(7)加酶标二抗：新鲜稀释的酶标抗体(1:30000)100ul/孔，室温孵育1h；
(8)洗板：洗涤液300ul/孔，3min，洗5次；
(9)显色：新鲜配置的TMB显色液，100ul/孔，室温避光孵育5-10min；
(10)终止：终止液2M H2SO4，50ul/孔；
(11)测定：酶标仪调至450nm，以第一个空白PBS对照孔调零后测各孔OD值。
3.结果分析和判定标准：
使用SPSS22.0软件绘制ROC曲线，根据坐标值，得出不同临界点所对应的特异度和敏感度，然后计算约登指数(约登指数＝特异度+敏感度-1)，得到三种抗原的临界点OD值分别为，Rv0248为0.3475、Rv2002为0.3048、Rv2421c为0.4173；
结果如图1所示，结果表明，三个蛋白均具有区分结核潜伏感染和活动性结核的作用。
判定标准：
使用三种蛋白联合检测，若待测样品的检测结果中，抗Rv0284抗体、抗Rv2002抗体和/或抗Rv2421c抗体中，至少有2种抗体呈阳性，则判定该待测样品是活动性结核阳性，否则为结核潜伏感染。
实施例3：应用ELISA鉴别诊断活动性结核病人和潜伏感染者的方法的特异性和敏感性
采用临床诊断为活动性肺结核的患者血清92份，潜伏感染者血清93份；利用实施例1和2中的ELISA方法进行检测，通过实施例2的判定标准判定待测者是否为活动性肺结核阳性，结果如图2所示，结果分析特异性为83.87％，敏感性为79.35％。图2中横坐标1-特异度代表假阳性率，纵坐标敏感性代表真阳性率。
以上结果证明本发明检测三个不同结核分枝杆菌蛋白血清抗体应答的水平，可以更好地鉴别诊断结核潜伏性感染者及活动性结核病病人，灵敏度更高，特异性更好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院
<120> 结核分枝杆菌蛋白在制备诊断结核潜伏感染者和/或活动性肺结核产品
中的用途
<130> None
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 645
<212> PRT
<213> 结核分歧杆菌
<400> 1
Met Val Glu Val Glu Arg His Ser Tyr Asp Val Val Val Ile Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ala Gly Leu Arg Ala Val Ile Glu Ala Arg Glu Arg Gly Leu
20 25 30
Lys Val Ala Val Val Cys Lys Ser Leu Phe Gly Lys Ala His Thr Val
35 40 45
Met Ala Glu Gly Gly Cys Ala Ala Ala Met Gly Asn Ala Asn Pro Lys
50 55 60
Asp Asn Trp Lys Thr His Phe Gly Asp Thr Met Arg Gly Gly Lys Phe
65 70 75 80
Leu Asn Asn Trp Arg Met Ala Glu Leu His Ala Lys Glu Ala Pro Asp
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Arg Val Trp Glu Leu Glu Thr Tyr Gly Ala Leu Phe Asp Arg Thr Asp
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115 120 125
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130 135 140
Gln Gln Lys Val Val Ser Leu Gln Gln Glu Asp His Ala Glu Leu Gly
145 150 155 160
Asp Tyr Glu Ala Arg Ile Lys Val Phe Ala Glu Cys Thr Ile Thr Glu
165 170 175
Leu Leu Lys Asp Gln Gly Ala Ile Ala Gly Ala Phe Gly Tyr Trp Arg
180 185 190
Glu Ser Gly Arg Phe Ile Val Phe Glu Ala Pro Ala Val Val Leu Ala
195 200 205
Thr Gly Gly Ile Gly Lys Ser Phe Lys Val Thr Ser Asn Ser Trp Glu
210 215 220
Tyr Thr Gly Asp Gly His Ala Leu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Thr Leu
225 230 235 240
Asn Met Glu Phe Val Gln Phe His Pro Thr Gly Met Val Trp Pro Pro
245 250 255
Ser Val Lys Gly Ile Leu Val Thr Glu Gly Val Arg Gly Asp Gly Gly
260 265 270
Val Leu Lys Asn Ser Glu Asn Ser Arg Phe Met Phe Asp Tyr Ile Pro
275 280 285
Pro Val Phe Lys Gly Gln Tyr Ala Glu Thr Glu Glu Glu Ala Asp Gln
290 295 300
Trp Leu Lys Asp Asn Asp Ser Ala Arg Arg Thr Pro Asp Leu Leu Pro
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Arg Asp Glu Val Ala Arg Ala Ile Asn Ser Glu Val Lys Ala Gly Arg
325 330 335
Gly Thr Pro His Gly Gly Val Tyr Leu Asp Ile Ala Ser Arg Leu Thr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Lys Arg Arg Leu Pro Ser Met Tyr His Gln Phe Lys
355 360 365
Glu Leu Ala Glu Val Asp Ile Thr Thr Gln Ala Met Glu Val Gly Pro
370 375 380
Thr Cys His Tyr Val Met Gly Gly Val Glu Val Asp Ala Asp Thr Gly
385 390 395 400
Ala Ala Thr Val Pro Gly Leu Phe Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Gly
405 410 415
Met His Gly Ser Asn Arg Leu Gly Gly Asn Ser Leu Ser Asp Leu Leu
420 425 430
Val Phe Gly Arg Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ala Asp Tyr Val Arg Ala
435 440 445
Leu Ser Ser Arg Pro Ala Val Ser Ala Glu Ala Ile Asp Ala Ala Ala
450 455 460
Gln Gln Ala Leu Ser Pro Phe Glu Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro
465 470 475 480
Glu Asn Pro Tyr Ala Leu His Met Asp Leu Gln Tyr Val Met Asn Asp
485 490 495
Leu Val Gly Ile Ile Arg Asn Ala Asp Glu Ile Ser Arg Ala Leu Thr
500 505 510
Leu Leu Ala Glu Leu Trp Ser Arg Tyr His Asn Val Leu Val Glu Gly
515 520 525
His Arg Gln Tyr Asn Pro Gly Trp Asn Leu Ser Ile Asp Leu Arg Asn
530 535 540
Met Leu Leu Val Ser Glu Cys Val Ala Arg Ala Ala Leu Gln Arg Thr
545 550 555 560
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580 585 590
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<212> PRT
<213> 结核分歧杆菌
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Lys Val Val Phe Gly Asp Ile Leu Asp Glu Glu Gly Lys Ala Val Ala
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Ala Glu Leu Ala Asp Ala Ala Arg Tyr Val His Leu Asp Val Thr Gln
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Leu His Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Leu Asn Ile Gly Thr
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Arg Gly Leu Thr Lys Ser Thr Ala Leu Glu Leu Gly Pro Ser Gly Ile
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<211> 211
<212> PRT
<213> 结核分歧杆菌
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210