检测雌酚和双酚A的电化学免疫传感器及其制备方法和应用与流程

本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，涉及一种检测雌酚和双酚A的电化学免疫传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)、己烷雌酚(hexestrol，HEX)和己二烯雌酚(dienestrol，DIEN)(结构见式1)是一类人工合成的具有雌性激素作用的药物，因具有促进动物生长、提高饲料转化率和减少脂肪合成等作用，曾被批准为促生长剂而大量应用于畜牧养殖业。此类药物的滥用会通过食物链最终到危害人类健康，引发各种严重后果，如发育异常、肿瘤、胎儿畸形等，因此在我国和欧美等国家已经明令禁止在动物养殖过程中使用。

双酚A(bisphenol A，BPA)(结构见式1)在聚碳酸酯、环氧树脂等多种高分子材料生产中广泛使用，并大量应用于生活塑料制品中，如饮用水瓶、婴儿奶瓶等，同时也应用于金属表面的涂层，使罐头食品不易恶化、变质。BPA能导致内分泌失调，威胁着胎儿和儿童的健康。癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与此有关。欧盟认为含双酚A的奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含双酚A的婴儿奶瓶。

目前用于检测雌酚和双酚A的方法主要有气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，操作过程繁琐、使用及维护成本高昂，难以满足日益增强的现场快速检测需要，因此有必要研究建立更加高效快速、灵敏度高、成本低廉的分析测试方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测雌酚和双酚A的电化学免疫传感器。

本发明的另一目的在于提供一种检测雌酚和双酚A的方法，所述检测方法快速、高效、灵敏度高。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测雌酚和双酚A的电化学免疫传感器，包括基底玻碳电极，其特征在于，所述传感器的基底玻碳电极表面沉积有纳米金颗粒，N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺通过自组装的方法修饰在所述的纳米金颗粒表面。

所述电化学免疫传感器采用以下方法制备：

(Ⅰ)将清洁干净的玻碳电极浸入质量百分浓度为0.5％的氯金酸溶液中，采用恒电位法将氯金酸还原为纳米金颗粒从而沉积于玻碳电极表面；

(Ⅱ)将沉积纳米金颗粒的玻碳电极浸入1mmol/L的N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺溶液中，4℃条件下反应，制得纳米金和N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修饰的电化学免疫传感器。

所述N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺结构如下式所示：

所述N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺采用以下方法制备：

(a)将N-乙酰半胱胺溶于四氢呋喃，在0℃下分批加入N-溴代琥珀酰亚胺，继续在0℃下反应2小时，旋转蒸发除去溶剂后过中性氧化铝柱纯化，得到α-溴代N-乙酰半胱胺；

(b)将步骤(a)所述的α-溴代N-乙酰半胱胺溶于丙酮，得到A液；将己烷雌酚溶于二氧六环得到B液，A液缓慢滴入B液，再缓慢滴入碳酸钠溶液，70℃搅拌反应12h；抽滤，将所得滤液旋转蒸发除去溶剂后的产物溶于沸腾的氯仿，过滤，向所得滤液中加入石油醚，10000r/m下离心20分钟，弃去上清液，残余物真空干燥，制得N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺。

合成路线如下所示：

一种基于电化学免疫传感器的检测雌酚和双酚A的方法，包括以下步骤：

(1)标准溶液的配制：配制含有雌酚或双酚A的磷酸缓冲溶液，其中均含有浓度为0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体，作为标准溶液；

(2)工作曲线的建立：将上述电化学免疫传感器浸入步骤(1)所述标准溶液中孵育，然后转移至含有K₃[Fe(CN)₆]的KCl溶液中进行电化学阻抗谱扫描，作出Nyquist图并计算出其电极表面的电荷转移电阻R_ct；将传感器未经孵育直接在KCl溶液中所测得的R_ct值记为R₀，将传感器在含有雌酚或双酚A的标准溶液中孵育后在KCl溶液中所测得的R_ct值记为R_x，R_ct的变化值ΔR_ct等于R_x与R₀的差值；将所述ΔR_ct与雌酚或双酚A的浓度对数值lgC绘制成ΔR_ct-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔR_ct-lgC线性回归方程；

(3)雌酚和双酚A的检测：将待测样品配制为含有与步骤(1)相同浓度的己烷雌酚单克隆抗体的磷酸缓冲溶液，按照与步骤(2)相同的方法对上述电化学免疫传感器进行孵育和电化学阻抗谱扫描，计算得到其电荷转移电阻R_ct；根据ΔR_ct-lgC线性回归方程，计算得到样品中雌酚或双酚A的浓度C。

所述雌酚分别为己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚。

本发明提供的电化学免疫传感器及检测方法可用于多种实际样品中雌酚和双酚A的检测，所述实际样品包括但不限于食品、土壤、水质、塑料等。

本发明提供的传感器及方法用于雌酚和双酚A的检测，检测限分别为己烯雌酚和己烷雌酚0.25ng/mL、己二烯雌酚0.15ng/mL、双酚A 0.2ng/mL；线性范围均为0.5～2000ng/mL。

本发明具有如下的有益效果：由于传感器表面采用化学法修饰了N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺，使用后经过简单处理即可再生，可重复利用，减少了能源的消耗，并且所述的检测方法具有较低的检出限(0.15ng/mL～0.25ng/mL)和较宽的线性范围(0.5～2000ng/mL)。

本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。

附图说明

图1为电化学免疫传感器对己烯雌酚进行检测的EIS曲线图。

图2为电荷转移电阻的变化值ΔR_ct与己烯雌酚浓度对数值lgC的工作曲线图。

图3为电化学免疫传感器对己烷雌酚进行检测的EIS曲线图。

图4为电荷转移电阻的变化值ΔR_ct与己烷雌酚浓度对数值lgC的工作曲线图。

图5为电化学免疫传感器对己二烯雌酚进行检测的EIS曲线图。

图6为电荷转移电阻的变化值ΔR_ct与己二烯雌酚浓度对数值lgC的工作曲线图。

图7为电化学免疫传感器对双酚A进行检测的EIS曲线图。

图8为电荷转移电阻的变化值ΔR_ct与双酚A浓度对数值lgC的工作曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例结合附图对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺的合成

1)α-溴代N-乙酰半胱胺的合成

将N-乙酰半胱胺(119mg，1mmol)溶于10ml四氢呋喃，冷却至0℃后分批加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS，195mg，1.1mmol)，继续在0℃下反应2小时，旋转蒸发除去溶剂后过中性氧化铝柱纯化，得产物α-溴代N-乙酰半胱胺135mg(产率68％)。

2)N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺的合成

将99mg(0.5mmol)α-溴代N-乙酰半胱胺溶于1ml丙酮中，得到A液；取122mg(0.5mmol)己烷雌酚溶于5ml二氧六环得B液，A液缓慢滴入B液，再缓慢滴入0.5ml的碳酸钠溶液(1mol/L)，70℃搅拌反应12h。抽滤，将所得滤液旋转蒸发除去溶剂后的产物溶于15ml沸腾的氯仿，过滤，向所得滤液中加入石油醚，10000r/m下离心20分钟，弃去上清液，残余物真空干燥得产物N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺81mg(产率45％)。

合成路线如下所示：

实施例2对己烯雌酚标准样品的检测

1)电化学免疫传感器的制备：

将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃抛光粉打磨，依次用无水乙醇-蒸馏水、蒸馏水超声清洗2min，再用蒸馏水冲洗干净。将上述电极置于1％的氯金酸溶液中进行恒电位电化学沉积(电压为-0.2V，沉积时间30s)，用去离子水冲洗干净后浸入1mmol/L的N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺溶液中，置于4℃冰箱中反应24小时，即可得到纳米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修饰的电化学免疫传感器。

2)己烯雌酚标准样品的检测：

将步骤1)中所述的电化学免疫传感器浸入总体积为50μL的含有浓度为0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体和一系列不同浓度的己烯雌酚的标准溶液中，37℃孵育30分钟，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于含有2mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]的KCl溶液(0.1mol/L)中进行电化学阻抗谱(EIS)扫描，作出Nyquist图并计算出其电极表面的电荷转移电阻(R_ct)。EIS曲线图如图1所示，图中曲线从上到下浓度依次为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL。将传感器未经孵育直接在KCl溶液中所测得的R_ct值记为R₀，与含有一定浓度己烯雌酚的标准溶液孵育后所测得的R_ct值记为R_x，R_ct的变化值ΔR_ct等于R_x与R₀的差值；将所述ΔR_ct与己烯雌酚的浓度对数值lgC(ng/mL)绘制成ΔR_ct-lgC工作曲线。工作曲线图如图2所示，采用线性回归法得到其ΔR_ct-lgC线性回归方程为ΔR_ct(Ω)＝487.7575-86.5832lgC(ng/mL)，己烯雌酚的浓度在0.5～2000ng/mL范围内ΔR_ct与lgC成正比，线性相关系数为0.9962。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测己烯雌酚的样品检测限为0.25ng/mL。将待测样品在上述条件下进行孵育和扫描并计算出其电荷转移电阻R_ct；根据R_ct的变化值ΔR_ct和ΔR_ct-lgC线性回归方程，可计算出待测样品中己烯雌酚的浓度C。

实施例3对己烷雌酚标准样品的检测

以与实施例2步骤1)完全相同的方法制备纳米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修饰的电化学免疫传感器，将其浸入总体积为50μL的含有浓度为0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体和一系列不同浓度的己烷雌酚的标准溶液中，再用与实施例2步骤2)相同的方法进行EIS扫描和数据处理。EIS曲线图如图3所示，图中曲线从上到下浓度依次为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL。所得到的电荷转移电阻变化值ΔR_ct与己烷雌酚浓度对数值lgC在己烷雌酚浓度在0.5～2000ng/mL之间时成线性关系，工作曲线图如图4所示，线性相关系数为0.9936，线性回归方程为ΔR_ct(Ω)＝474.9995-102.8059lgC(ng/mL)。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测己烷雌酚的样品检测限为0.25ng/mL。

实施例4对己二烯雌酚标准样品的检测

以与实施例2步骤1)完全相同的方法制备纳米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修饰的电化学免疫传感器，将其浸入总体积为50μL的含有浓度为0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体和一系列不同浓度的己二烯雌酚的标准溶液中，再用与实施例2步骤2)相同的方法进行EIS扫描和数据处理。EIS曲线图如图5所示，图中曲线从上到下浓度依次为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL。所得到的电荷转移电阻变化值ΔR_ct与己二烯雌酚浓度对数值lgC在己二烯雌酚浓度在0.5～2000ng/mL之间时成线性关系，工作曲线图如图6所示，线性相关系数为0.9933，线性回归方程为ΔR_ct(Ω)＝407.9338-72.3777lgC(ng/mL)。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测己二烯雌酚的样品检测限为0.15ng/mL。

实施例5对双酚A标准样品的检测

以与实施例2步骤1)完全相同的方法制备纳米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修饰的电化学免疫传感器，将其浸入总体积为50μL的含有浓度为0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体和一系列不同浓度的双酚A的标准溶液中，再用与实施例2步骤2)相同的方法进行EIS扫描和数据处理。EIS曲线图如图7所示，图中曲线从上到下浓度依次为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、200ng/mL和1000ng/mL。所得到的电荷转移电阻变化值ΔR_ct与双酚A浓度对数值lgC在己二烯雌酚浓度在0.5～1000ng/mL之间时成线性关系，工作曲线图如图8所示，线性相关系数为0.9903，线性回归方程为ΔR_ct(Ω)＝359.0275-60.9422lgC(ng/mL)。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测双酚A的样品检测限为0.20ng/mL。

实施例6奶粉中加标己烯雌酚的测定

1)奶粉样品的处理：称取1±0.0050g奶粉于到10mL的样品管中，加入己烯雌酚标准溶液和6mL正己烷，混合物超声分散30分钟，于2000r/m下离心10分钟，将上清液转移至氮吹管中，残渣用3mL的相同提取液重复提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹条件下于50℃温度下浓缩蒸发，浓缩物加入1mL的pH为7.4磷酸缓冲溶液溶解后用于电化学分析。

2)奶粉样品中加标己烯雌酚的测定：分别取不同体积的奶粉提取液样品，加入到磷酸缓冲溶液中配制成一系列含有不同浓度己烯雌酚和相同浓度己烷雌酚单克隆抗体且总体积均为200μL的孵育液。将纳米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修饰的电化学免疫传感器浸入上述孵育液中，采用与实施例2中步骤2)相同的方法进行孵育、EIS扫描和数据处理，计算出己烯雌酚的浓度C，检测回收率结果见表1。

表1为加标奶粉中的己烯雌酚浓度的回收率结果

实施例7猪肉中加标己烷雌酚的测定

1)猪肉样品的处理：称取1±0.0050g猪肉于到10mL的样品管中，加入己烷雌酚标准溶液和3mL乙腈-丙酮提取液(V：V＝4：1)，混合物超声分散30分钟，于2000r/m下离心10分钟，将上清液转移至氮吹管中，残渣用3mL的相同提取液重复提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹条件下于50℃温度下浓缩蒸发，浓缩物加入1mL的pH为7.4磷酸缓冲溶液溶解后用于电化学分析。

2)猪肉样品中加标己烷雌酚的测定：分别取不同体积的猪肉提取液样品，加入到磷酸缓冲溶液中配制成一系列含有不同浓度己烷雌酚和相同浓度己烷雌酚单克隆抗体且总体积均为200μL的孵育液。将纳米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修饰的电化学免疫传感器浸入上述孵育液中，采用与实施例2中步骤2)相同的方法进行孵育、EIS扫描和数据处理，计算出己烷雌酚的浓度C，检测回收率结果见表2。

表2为加标猪肉中的己烷雌酚浓度的回收率结果

按照与实施例7基本相同的方法，也可进行各种动物源性食品，包括猪、牛、羊等常用动物的肉制品、内脏等中含有的己烯雌酚、己二烯雌酚的检测。

实施例8土壤样品中加标己二烯雌酚的测定

1)土壤样品的处理：称取1±0.0050g土壤，研磨粉碎后加入到10mL的样品管中，加入己二烯雌酚标准溶液和3mL乙腈-丙酮提取液(V：V＝4：1)，混合物超声分散30分钟，于2000r/m下离心10分钟，将上清液转移至氮吹管中，残渣用3mL的相同提取液重复提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹条件下于50℃温度下浓缩蒸发，浓缩物加入1mL的pH为7.4磷酸缓冲溶液溶解后用于电化学分析。

2)土壤样品中加标己二烯雌酚的测定：分别取不同体积的土壤提取液样品，加入到磷酸缓冲溶液中配制成一系列含有不同浓度己二烯雌酚和相同浓度己烷雌酚单克隆抗体且总体积均为200μL的孵育液。将纳米金/N-(己烷雌酚氧基)乙酰半胱胺修饰的电化学免疫传感器浸入上述孵育液中，采用与实施例2中步骤2)相同的方法进行孵育、EIS扫描和数据处理，计算出己二烯雌酚的浓度C，检测回收率结果见表3。

表3为免疫传感器检测加标土壤中的己二烯雌酚浓度的回收率