本发明涉及一种以人血清为基质的葡萄糖标准物质，具体说是涉及一种血清葡萄糖标准物质的制备方法。
背景技术：
我国糖尿病患病率呈迅速增加趋势，由糖尿病导致的微血管并发症(视网膜病变、糖尿病肾病、神经病变和糖尿病足)及大血管并发症(心、脑血管疾病)的发生率、致残率和致死率极高，严重威胁糖尿病患者的生存质量甚至生命，也给医疗资源和社会经济造成巨大的负担，因此，临床准确测定血清中葡萄糖的浓度，是糖尿病的早期诊断以及糖尿病患者血糖水平合理控制是关键所在。
标准物质用于校准测量系统、评价测量程序或为材料赋值。随着临床实验室常规化学标本检测量的增加，标准物质的需要量也相应大量增加。标准物质的制备途径主要有：人工合成、自然界物质提纯、人或动物组织来源提纯品或者基因工程重组标准物质。作为质控物质，最好选用天然的物质，与待测标本具有尽可能的相似性，否则将不具有充分的代表性。因此研制临床检验用的人血清质冰冻混合血清标准物质势在必行。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种有良好均匀性、稳定性及互通性，符合《一级标准物质技术规范》及ISO Guide35的要求，采用新鲜血液制备，来源广泛，制备方法简单的血清葡萄糖标准物质的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种血清葡萄糖标准物质的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：
(1)血清的制备：起始原料来源健康捐助者血液，每个捐助者抽取全血后，得到血清量为110-170毫升；
(2)血清的处理：将各捐助者的血清混合，添加纯葡萄糖物质至目标浓度5-7mmol/L，离心以实现均一、澄清的“候选血清标准物质”；
所述的“候选血清标准物质”经无菌过滤后分装于经灭菌干燥的棕色安培瓶中，每瓶1毫升，-70℃冰冻储存；得到互通性良好、均一稳定、量值溯源可靠的、浓度水平为5-7mmol/L人血清基质标准物质。
作为优选：所述的健康捐助者选择标准为年龄20-50岁、血脂水平适当、人类免疫缺陷病毒抗体和乙型、丙型肝炎表面抗原阴性；每个捐助者抽取300-400毫升全血，平均得到血清量为140毫升。
作为优选：所述的健康捐助者在餐前抽血，收集于干燥的、不含任何添加剂的离子瓶中，放置在室温下凝血3-4小时，在2000～3000g下离心20分钟，从血块中分离出血清。
血清混合后测定葡萄糖初浓度，添加纯葡萄糖物质至目标浓度，在6000～9000g下离心20分钟，取上清液以尽量去除血清样本中的凝血、纤维蛋白等成分，目测为清晰、淡黄色且无颗粒物质，紫外分光光度仪在波长710nm、比色皿1厘米条件下吸光度A不超过0.5，若不符合则继续在6000～9000g下离心20分钟。
作为优选：所述的添加纯葡萄糖物质为编号GBW10062的标准物质；葡萄糖浓度的定值方法为气相色谱-同位素稀释质谱法。
作为优选：所述“候选血清标准物质”在生物安全柜中进行负压抽吸过滤，血清依次经过0.45、0.22μm等亲水膜进行无菌过滤。
本发明相对于现有技术存在如下技术效果：该标准物质具有良好的均匀性、稳定性及互通性，符合《一级标准物质技术规范》及ISO Guide35的要求；标准物质采用新鲜血液制备，来源广泛，制备简单，使用方便；在-70℃可长期储存，对于常规检测系统的溯源和质量评价以及协作研究分析中的质量保证都可发挥作用，具有很大的应用前景。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步的描述。
本发明所述的一种血清葡萄糖标准物质的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)血清的制备：起始原料来源健康捐助者血液，每个捐助者抽取全血后，得到血清量为110-170毫升；
(2)血清的处理：将各捐助者的血清混合，添加纯葡萄糖物质至目标浓度5-7mmol/L，离心以实现均一、澄清的“候选血清标准物质”；
所述的“候选血清标准物质”经无菌过滤后分装于经灭菌干燥的棕色安培瓶中，每瓶1毫升，-70℃冰冻储存；得到互通性良好、均一稳定、量值溯源可靠的、浓度水平为5-7mmol/L人血清基质标准物质。
本发明所述的健康捐助者选择标准为年龄20-50岁、血脂水平适当、人类免疫缺陷病毒抗体和乙型、丙型肝炎表面抗原阴性；每个捐助者抽取300-400毫升全血，平均得到血清量为140毫升。
本发明所述的健康捐助者在餐前抽血，收集于干燥的、不含任何添加剂的离子瓶中，放置在室温下凝血3-4小时，在2000～3000g下离心20分钟，从血块中分离出血清。
血清混合后测定葡萄糖初浓度，添加纯葡萄糖物质至目标浓度，在6000～9000g下离心20分钟，取上清液以尽量去除血清样本中的凝血、纤维蛋白等成分，目测为清晰、淡黄色且无颗粒物质，紫外分光光度仪在波长710nm、比色皿1厘米条件下吸光度A不超过0.5，若不符合则继续在6000～9000g下离心20分钟。
所述的添加纯葡萄糖物质为编号GBW10062的标准物质；葡萄糖浓度的定值方法为检验医学溯源联合委员会(JCTLM)认可公布的一级参考测量方法(气相色谱-同位素稀释质谱法)，可确保相关测量工作的溯源性。
本发明所述的“候选血清标准物质”在生物安全柜中进行负压抽吸过滤，血清依次经过0.45、0.22μm等亲水膜进行无菌过滤。
实施例：本发明所述的血清葡萄糖标准物质的制备方法包括以下步骤：
(1).血清的制备：起始原料来源健康捐助者血液。健康捐助者选择标准为年龄20-50岁、血脂水平适当、人类免疫缺陷病毒抗体和乙型、丙型肝炎表面抗原阴性，共选取4名捐助者，每个捐助者在餐前抽取约300毫升全血，收集于干燥的离子瓶中(不含任何添加剂)，放置在室温下凝血3-4小时，在2000～3000g下离心20分钟，从血块中分离出血清；
(2).血清的处理：将各捐助者的血清混合，约为550毫升，测定葡萄糖初浓度，添加纯葡萄糖物质(标准物质GBW10062)至目标浓度(5-7mmol/L)，该浓度为医学决定水平，保证检测质量，以减少糖尿病的漏诊率和误诊率。混合血清添加纯物质后在6000～9000g下离心20分钟，取上清液以尽量去除血清样本中的凝血、纤维蛋白等成分，目测为清晰、淡黄色且无颗粒物质，紫外分光光度仪在波长710nm、比色皿1厘米条件下吸光度A不超过0.5，若不符合则继续在6000～9000g下离心20分钟，以实现均一、澄清的“候选血清标准物质”。在生物安全柜中进行负压抽吸过滤，血清依次经过0.45、0.22μm等亲水膜进行无菌过滤后，分装于经灭菌干燥的棕色安培瓶中，每瓶1毫升，共450瓶，-70℃冰冻储存。
(3).均匀性检验：均匀性是标准物质的重要属性之一，根据《一级标准物质技术规范》及ISO Guide35的要求，该血清标准物质是液体，属于均匀性良好的样品，从制备的450瓶样本中随机抽取10瓶，每瓶重复测定3次，进行均匀性检验。
血清葡萄糖标准物质均匀性检验测量数据结果及统计结果见表1～3，在显著性水平a＝0.05下，采用F检验法对表1中数据进行统计分析。
x11，x12，……x1n1，
x21，x22，.……x2n2，
………………………...，
xm1，xm2，……xmnm，
设
组间平方和为
组内平方和为
v1＝m-1
v2＝N-m
作统计量F：
根据自由度为(ν1，ν2)及给定的显著性水平α，可由表查得临界的F值，算得F值为1.452，小于Fα(2.393)，说明分装后的血清葡萄糖标准物质组内与组间无明显差异，样品是均匀的。
表1血清葡萄糖标准物质均匀性检验测量数据(单位mmol/L)
表2血清葡萄糖标准物质均匀性检测结果方差分析(单位mmol/L)
表3血清葡萄糖标准物质均匀性统计学分析结果
3.稳定性评估
为了评估血清葡萄糖标准物质的稳定性，本发明观察了该标准物质的短期稳定性和长期稳定性。短期稳定性主要测试在模拟标准物质运输条件下的稳定性，长期稳定性则是测试标准物质在长期贮存条件下的稳定性。
血清葡萄糖标准物质稳定性评估测量数据结果及统计结果见表4～5，选用平均值一致性检验法进行稳定性分析。以不同保存时间的测试结果与第一次的测试结果进行比较分析。按照公式：
进行计算，其中s1,n1为第一次标准物质稳定性检测测量数据的平均值、标准偏差、测量次数。s2,n2为间隔一定时间后，第二次标准物质稳定性检测测量数据的平均值、标准偏差、测量次数。
当t与显著性水平α，自由度为n1+n2-2时的t检验临界值tα(n1+n2-2)之间的关系为：t≤tα(n1+n2-2)时，认为该标准物质的特性量值没有发生显著性变化，否则认为该标准物质的特性量值已发生显著性变化。
3.1短期稳定性评估
短期稳定性实验关注的是在特定运输条件下标准物质的稳定性。根据目前我国的运输条件，使用快递运输，货物2天内可以运送到我国主要城市。本实验的设计如下：模拟标准物质发样及运输过程的环境，分析在此过程中葡萄糖浓度的改变状况。具体包括以下几个步骤：首先将贮存于-70℃环境中标准物质迅速取出，在干冰温度下进行运输前的内外包装。外包装采用壁厚为1.8cm的泡沫盒，每个泡沫盒中加入干冰1kg。
将装有标准物质候选物和干冰的泡沫盒置于室温(25℃)环境中，在贮存的第0h，9h，24h，33h，48h，57h，72h对其进行取样，取样后置于-70℃冰箱。每次取样前观察标准物质的状态，变为液态后即停止取样检测。待全部取样完毕后，对样本进行葡萄糖浓度检测。
表4血清葡萄糖标准物质短期稳定性评估测量结果(单位mmol/L)
3.2长期稳定性评估
长期稳定性实验关注的是在特定贮存条件下标准物质葡萄糖浓度的稳定性状况。本实验即是在-70℃贮存条件下，对贮存的标准物质进行取样分析。
表5血清葡萄糖标准物质长期稳定性评估测量结果(单位mmol/L)
4.定值
4.1气质联用仪GC-MS(Agilent 7890-5975C)参数设置
色谱柱：Agilent DB-5毛细管柱；载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min；进样方式为分流，进样量为1μL，分流比为10:1，进样口温度270℃；柱温从80℃，以20℃/min速率升温到280℃，保持10min；离子源温度：230℃；采集方式：Scan和SIM(选择离子监测)，选择检测离子：m/z 314和m/z 319。
4.2样本衍生处理
精确称取D一葡萄糖纯品标准物质(GBW10062)、D-[I3C6]葡萄糖标记物(ALDRICH)溶于纯水中；精确量取标准物质、D一葡萄糖纯品标准液(约100μl)，加入一定量的葡萄糖标记物溶液，轻摇充分混匀，在4℃冰箱平衡2小时；向已添加标记物的样品中加入0.8mL无水乙醇，振荡混匀，在4℃下以5000r/min离心10min除去蛋白，取上层清液，60℃下氮气吹干；加入150μL盐酸羟胺的吡啶溶液(0.2mol/L)，混匀，90℃下反应0.5小时；冷却后，再加入200μL乙酸酐，混匀，90℃下反应0.5小时；60℃下氮气吹干，加入500μL二氯甲烷复溶，过有机滤膜，进行GC/ID-MS的检测。
4.3样本中葡萄糖浓度计算结果
根据葡萄糖衍生物质谱离子m/z 314与m/z 319的峰面积比，采用内标单点法计算，结果见表6。
表6血清葡萄糖标准物质定值数据(单位mmol/L)
5.不确定度评定
根据Guide 35《标准物质/标准样品的定值—通用原则和统计原理》的要求，采用GUM和QUAM的原则和方法对标准物质特性值的不确定度分量进行量化。
特性值的不确定度来源主要有：1)纯品标准物质的不确定度；2)特性值测量过程引起的不确定度；3)瓶间差引起的不确定度；4)稳定性引起的不确定度。
5.1标准不确定度的计算
1)纯品标准物质GBW10062的标准不确定度u1：
GBW10062葡萄糖定值为99.6％，扩展不确定度为0.5％(k＝2)，因此其贡献的相对标准不确定度为：0.5％÷2＝0.25％。
2)测量过程引入的标准不确定度u2：
测量过程引入的标准不确定度为测量结果的标准偏差SD，其相对标准不确定度为测量相对变异系数CV＝0.42％
3)瓶间差引起的标准不确定度u3：
标准物质候的均匀性数据进行单因素方差分析见表2，评估其瓶间不均匀性引入的标准不确定度。
即均匀性引起的相对标准不确定为0.34％。
4)稳定性引起的不确定度u4：
标准物质候选物长期稳定性数据见表5。选用直线方程作为标准物质的经验模型，拟合直线并计算与斜率相关的不确定度为其长期稳定性引起的不确定度，结果见表7：
表7长期稳定性引起的不确定度评估
5.2合成不确定度的计算
根据下列公式计算合成标准不确定度：
血清葡萄糖标准物质定值的合成标准不确定度＝5.84mmol/L×0.686％＝0.04mmol/L。
扩展不确定度包含因子k＝2，U＝k×Uc＝2×0.04＝0.08mmol/L。
本发明制备的标准物质：葡萄糖标示值为5.84mmol/L，扩展不确定度为0.08mmol/L(k＝2)。