一种山西老陈醋指纹图谱的构建方法和应用与流程

本发明涉及柱色谱法，特别涉及一种山西老陈醋高效液相指纹图谱的构建方法和应用。

背景技术：

食醋是深受人们喜爱的调味品之一，我国的食醋酿造历史悠久，各地食醋种类丰富，因酿造方法不同，其成分也有所差异。其中，山西老陈醋因“选料上乘、工艺独特、营养丰富、养身健体、风味独特、品质优良、色香味俱佳”而被誉为“天下第一醋”。山西老陈醋化学成分多样，据报道，其中含有糖类、氨基酸、酸类、醇类、醛类、酯类、多酚类等成分。现行的山西老陈醋国家标准中要求川芎嗪含量应不低于30mg/l，总黄酮含量应不低于60mg/100g。文献报道陈放两月后的镇江香醋中川芎嗪含量可达77mg/l，(镇江香醋中川芎嗪测定及生成机理的研究.贺铮怡等.中国调味品,第2期,2004)，说明现行的理化指标难以全面地反应山西老陈醋的品质特征。

指纹图谱可以获得样品的整体化学信息，可作为山西老陈醋质量控制的有效手段。现有的山西老陈醋指纹图谱主要是挥发性指纹(气相色谱/质谱法联用分析山西老陈醋香气成分.袁仲等.中国调味品,第36卷第5期,2011.)和强极性的水溶性成分的指纹(山西老陈醋中有机酸的hplc测定分析.吕利华等.食品科学,第28卷第11期,2007.山西老陈醋液相指纹图谱的构建方法和应用,发明专利申请号201510400315.x)。然而，酿造食醋中除上述成分外，还含有一些具有紫外吸收的中等极性成分，如阿魏酸、芥子酸等(isolationandidentificationofdpphradicalscavengingcompoundsinkurosu(japaneseunpolishedricevinegar).yumishimojietal.jouranalofagricultureandfoodchemistry,第50卷,第22期,2002)。这些成分大多具有一定的药理活性，如阿魏酸具有抑制血小板聚集、抑制5-羟色胺从血小板中释放、阻止静脉旁路血栓形成、抗动脉粥样硬化、抗氧化等作用。虽然这些成分在食醋中的含量不高，但是应该作为反映老陈醋质量的指标之一。然而目前尚无能反映这类成分的指纹图谱。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种山西老陈醋高效液相指纹图谱的构建方法及其在质量控制方面的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种山西老陈醋指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)测试溶液的制备：取山西老陈醋，加入体积比为0.1-10倍的乙酸乙酯萃取1-3次，萃取液浓缩蒸干，加入甲醇复溶，溶液过0.22μm微孔滤膜即可；

(2)吸取测试溶液至高效液相色谱仪测定，得到化学指纹图谱；所述液相色谱条件：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；紫外检测波长：240-320nm；柱温：25-35℃；进样量：1-20μl；流速：0.8-1.2ml/min；流动相：a相为乙腈，b相为0.08-0.12％磷酸水溶液，梯度洗脱，每1次完成后，系统平衡3min后再次进样。

所述步骤(1)中加入的乙酸乙酯体积比为1倍，萃取次数为1次。

所述步骤(2)中液相色谱条件为：柱温：30℃；进样量：10μl；流速：1ml/min；流动相b相为0.1％磷酸水溶液。

所述步骤(2)中检测波长为285nm；所述指纹图谱有10个特征峰，以3号峰为参照峰，相对保留时间：

1号峰：7.742±0.04；2号峰：1.049±0.03；3号峰：即s峰；4号峰：4.562±0.05；5号峰：16.480±0.03；6号峰：17.159±0.02；7号峰：18.895±0.04；8号峰：22.501±0.03；9号峰：25.124±0.04；10号峰：29.834±0.04。

所述步骤(2)中梯度洗脱的条件：0-2min，0％a相；2-45min，0％-20％a相；45-55min，20％-35％a相；55-65min，35％-55％a相；65-75min，55％-85％a相。

本发明的优点如下：

本发明对山西老陈醋中的一些具有紫外吸收的中等极性成分检测分析，利用高效液相色谱建立山西老陈醋指纹图谱的构建方法。且本发明具有灵敏、准确、稳定、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为不同检测波长山西老陈醋指纹图谱对比

图2为山西老陈醋的液相指纹图谱

图3为不同厂家山西老陈醋的液相指纹图谱

图4为山西老陈醋和其他种类食醋的液相指纹图谱对比

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。各实施例中使用到的试剂和器材如下：

1仪器

超声波清洗器(kq5200e，昆山市超声仪器有限公司)，waterse2695高效液相色谱仪(waters公司)、2489紫外检测器(waters公司)，empower工作站，色谱柱venusilmp(250×4.6mm，5μm)。

2试剂

乙腈(色谱纯，fisher公司)，甲醇(色谱纯，fisher公司)，磷酸(色谱纯，天津市致远化学试剂有限公司)，甲酸(色谱纯，fisher公司)。

3样本信息(见表1)

表1食醋样本信息表

实施例1色谱条件的确定及特征峰的指认

1、洗脱梯度的选择

实验中共选取了三种方法进行梯度洗脱：

(1)0-40min，0％-20％a相；40-50min，20％-35％a相；50-60min，35％-55％a相；55-65min，55％-85％a相；其中a相为乙腈，b相为0.1％磷酸水溶液。

(2)0-23min，0％-10％a相；23-50min，10％-20％a相；50-60min，20％-35％a相；60-10min，35％-55％a相；70-80min，55％-85％a相；其中a相为乙腈，b相为0.1％磷酸水溶液。

(3)0-2min，0％a相；2-45min，0％-20％a相；45-55min，20％-35％a相；55-65min，35％-55％a相；65-75min，55％-85％a相；其中a相为乙腈，b相为0.1％磷酸水溶液。

根据所出色谱峰的分离度和出峰时间综合考虑，选取条件(3)作为所述方法的梯度洗脱条件。

2、检测波长的选择

实验中共选取了四个检测波长，即254nm，285nm，300nm，320nm对山西老陈醋进行高效液相色谱的测定。如附图1所示，波长254nm、320nm下的色谱图可看到有5-7个较高的色谱峰；波长300nm下的色谱图有7-9个较高的色谱峰可作为山西老陈醋指纹图谱的特征峰；波长为285nm时测定的色谱图出峰最多，有9-12个吸收较强的色谱峰。综上，这四种检测波长下得到指纹图谱均有多个色谱峰，可作为山西老陈醋指纹图谱来反应其品质特征。但285nm下色谱峰的吸收最强，出峰最多，因此选择285nm作为检测波长的最优条件，并选择其图谱中的10个色谱峰作为山西老陈醋指纹图谱的特征峰，以3号峰为参照峰，其相对保留时间如下：

1号峰：7.742±0.04；2号峰：1.049±0.03；3号峰：即s峰；4号峰：4.562±0.05；5号峰：16.480±0.03；6号峰：17.159±0.02；7号峰：18.895±0.04；8号峰：22.501±0.03；9号峰：25.124±0.04；10号峰：29.834±0.04；(见图2)。

3、特征峰的指认

经对照品加样比对，确定山西老陈醋指纹图谱中所选的10个特征峰中包括以下化合物：

1号峰：未知；2号峰：5-羟甲基糠醛；3号峰：川芎嗪；4号峰：原儿茶酸；5号峰：香草酸；6号峰：咖啡酸；7号峰：丁香酸；8号峰：未知；9号峰：二氢阿魏酸；10号峰：阿魏酸。

实施例2指纹图谱方法学考察

下述实验的供试品溶液均采用如下方法制备：

取山西老陈醋50ml，加入体积比为1倍的乙酸乙酯萃取，取5ml萃取液浓缩蒸干，加入5ml甲醇复溶，溶液过0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得测试溶液。

稳定性实验：

取山西老陈醋c-007，分别在0小时、3小时、6小时、12小时、18小时和24小时进行测定，把3号峰作为参照峰，记录其余特征峰的相对保留时间和峰面积，并对其相对标准偏差(rsd)值进行计算，结果见表2，表3。

表2各特征峰的相对保留时间及rsd

表3各特征峰的相对峰面积及rsd

以上结果显示，山西老陈醋的待测试溶液在24h内通过高效液相色谱分析结果稳定，特征峰的相对保留时间和相对峰面积一致，其rsd值均小于4.0％，即样品溶液在24h内稳定性良好。

精密度实验：

取山西老陈醋c-007，重复进样6次，把3号峰作为参照峰(s)，记录其他9个特征峰的相对保留时间和峰面积，并对其rsd值进行计算，结果见表4，表5。

表4各特征峰的相对保留时间及rsd

表5各特征峰的相对保留时间及rsd

以上结果显示，山西老陈醋的待测试溶液通过高效液相色谱分析结果稳定，特征峰的相对保留时间和相对峰面积一致，其rsd值均小于4.0％，即仪器等整个检测系统的精密度良好。

重复性实验：

取山西老陈醋c-007，备样6份，进行高效液相色谱的测定，把3号峰作为参照峰(s)，记录其他9个特征峰的相对保留时间和峰面积，并对其rsd值进行计算，结果见表6，表7。

表6各特征峰的相对保留时间及rsd

表7各特征峰的相对保留时间及rsd

以上结果显示，6份山西老陈醋的待测试溶液通过高效液相色谱分析结果稳定，特征峰的相对保留时间和相对峰面积一致，其rsd值均小于6.0％，表明其重复性良好。

实施例3不同厂家山西老陈醋均一性评价

利用上述建立的山西老陈醋液相指纹图谱对11批山西老陈醋进行测定。

取山西老陈醋50ml，加入体积比为1倍的乙酸乙酯萃取，取5ml萃取液浓缩蒸干，加入5ml甲醇复溶，溶液过0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得测试溶液。以色谱柱venusilmp(250×4.6mm，5μm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：

紫外检测波长为285nm；柱温为30℃；进样量为10μl；流速为1ml/min；梯度洗脱条件为0-2min，0％a相；2-45min，0％-20％a相；45-55min，20％-35％a相；55-65min，35％-55％a相；65-75min，55％-85％a相(其中a相为乙腈，b相为0.1％磷酸水溶液)。每1次测样完成后，系统平衡3min后再次进样。

如图3所示，不同厂家的山西老陈醋得到的指纹图谱整体较为相近，从10个特征峰来看，11批山西老陈醋中各峰的峰面积相差较小。但各别样本的图谱与其他样本所差别，如d厂的s6(c-006号样本)图谱与其他图谱的区别在于22min处有较高的色谱峰；a厂家的s8图谱(c-008号样本)与其他图谱相比，在52min处出现较高的色谱峰。

实施例4山西老陈醋同其他种类食醋指纹图谱比较

利用上述山西老陈醋液相指纹图谱检测方法对山西老陈醋和其他4种食醋进行测定和比较(图4)。5种食醋的液相指纹图谱有较大差别，山西老陈醋中大多成分的含量明显高于其他种类的食醋。从图谱中可以直观地看到米醋色谱图中峰很少，且信号很低，说明其中紫外吸收成分含量特别低。与老陈醋指纹图谱相比，糯米香醋、镇江香醋和永春老醋的色谱图在保留时间20min到50min区域内色谱峰信号响应很低，但2号峰的信号响应明显高于老陈醋。这表明，本发明所提供的山西老陈醋液相指纹图谱的检测方法可以区分山西老陈醋与镇江香醋、糯米香醋、永春老醋及米醋，反应山西老陈醋的品质特色。