一种基于石墨烯量子点/铒离子荧光纳米探针的凝血酶检测方法与流程

本发明公开了一种基于石墨烯量子点/铒离子（gqds/er³⁺）荧光纳米探针的凝血酶检测方法，属于光学传感技术领域。

背景技术：

石墨烯量子点（gqds）是指粒径小于100nm的石墨烯纳米片，具有低毒性、良好的生物相容性和光稳定性等性能，被广泛用于物质检测、生物成像和荧光传感。shi等利用gqds-peg-aptamer为供体，二硫化钼纳米片为猝灭剂，建立了基于gqds荧光开关检测上皮细胞粘附分子蛋白的方法。qiu等建立了基于zr⁴⁺与磷酸化多肽-gqds复合物之间多重螯合作用的蛋白质激酶活性分析方法。qian等以功能化gqds表面偶联适配子为探针检测凝血酶。然而，以上基于gqds的传感器往往需要对gqds表面进行修饰，成本高且耗时长。

凝血酶（简写为tb）是一种多功能丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，具有促凝和抗凝双重特性。当血管组织损伤时，它可以促进凝血酶原转变成凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白，在血液凝固和心血管治疗中发挥着重要作用。但是，凝血过度也会导致体内血栓栓塞等疾病发生，甚至造成机体死亡。因此，对凝血酶含量进行测定对生理健康具有重要意义。目前已有的凝血酶检测方法有比色法、荧光法、电化学法和磁共振成像法等，其中，比色和荧光方法的成本低、灵敏度高、操作简单，大多数比色和荧光方法是基于凝血酶适配体与凝血酶反应前后构象变化导致的荧光变化实现凝血酶检测。zheng等以dna为模板合成ag/pt双金属纳米簇，用于比色法检测凝血酶。li等设计了一种发夹结构的dna，当加入凝血酶后，此发夹结构的环序列与凝血酶特异性结合，环状dna开环使得标记于dna两端的荧光供体和猝灭剂距离变远，荧光供体的荧光恢复，实现了凝血酶检测。然而，以上基于适配体的凝血酶检测方法大多需要对适配体进行化学修饰或标记荧光基团，不仅耗时、复杂而且价格昂贵。因此，发展免标记型荧光传感法用于检测凝血酶尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种基于石墨烯量子点/铒离子荧光纳米探针的凝血酶检测方法，该方法利用凝血酶存在与否时gqds/er³⁺荧光纳米探针的荧光开关变化实现对凝血酶的检测，具有简单、免标记、灵敏和选择性好等特点。

本发明是这样实现的，一种基于石墨烯量子点/铒离子荧光纳米探针的凝血酶检测方法，其特征在于，gqds溶液有良好的荧光发射性质，当将er³⁺加入到gqds溶液中时，gqds表面存在的羰基、羧基、羟基以及环氧基等含氧基团可与er³⁺发生配位作用形成gqds/er³⁺复合物，从而拉近了gqds之间的距离，使得gqds发生聚集而荧光猝灭，当向gqds/er³⁺中加入凝血酶后，凝血酶与gqds竞争er³⁺的结合位点，使得gqds从gqds/er³⁺复合物中脱离而分散到溶液中，导致gqds的荧光恢复，随着凝血酶浓度的增加，gqds的荧光恢复的程度逐渐增强，gqds的荧光强度与凝血酶浓度呈线性关系，可用于对凝血酶的灵敏和选择性检测；

所述的gqds制备步骤如下：

（1）将1.0g碳粉、60ml浓硝酸和180ml浓硫酸依次加入到250ml反应瓶中，在100%功率下超声2h；

（2）将上述溶液在120°c条件下回流24h，将混合物用超纯水稀释到800ml，得到深棕色溶液，用na2co3中和溶液ph为7左右，经浓缩过滤除去大部分钠盐，将滤液分批次在1000da透析袋中透析3天，透析袋中的产物即为gqds，将gqds分散到超纯水中备用。

作为优选，步骤（1）中，所述的浓硝酸的质量百分浓度为68%，所述的浓硫酸的质量百分浓度为98%。

本发明的技术效果是：利用石墨粉为原料制备的gqds具有稳定的荧光，当向gqds溶液中加入er³⁺时，er³⁺与gqds发生配位作用形成gqds/er³⁺复合物荧光纳米探针，拉近了gqds之间的距离而导致gqds的荧光减弱，当将凝血酶加入gqds/er³⁺荧光纳米探针溶液中时，凝血酶中的氮和氧等配位原子与er³⁺发生强的配位结合，使得gqds从gqds/er³⁺复合物中解离出来分散到溶液中，导致gqds的荧光恢复，随着凝血酶浓度的增加，gqds的荧光恢复程度逐渐增强，根据gqds的荧光强度可判断凝血酶的浓度，该方法具有简单、快速、灵敏度高和选择性好等优点。

附图说明

图1是gqds的（a）透射电镜和（b）粒径分布图。

图2是gqds的（a）红外光谱和（b）紫外-可见以及荧光光谱图。

图3是荧光光谱图：(a)gqds，(b)gqds/er³⁺，(c)gqds+tb，(d)gqds/er³⁺+tb。

图4是（a）gqds随着er³⁺浓度变化的动态光散射光谱图，内插图为散射强度随er³⁺浓度变化的趋势图；（b）gqds/er³⁺随着tb浓度变化的动态光散射光谱图，内插图为散射强度与tb浓度的线性关系图。

图5是（a）gqds/er³⁺与不同浓度tb（0~70nm）反应后gqds的荧光光谱图；（b）gqds的荧光强度值随tb浓度变化的趋势图，内插图：gqds的荧光强度与tb浓度的线性关系图。

图6是对tb检测的选择性图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此；

实施例1

gqds的制备

（1）将1.0g碳粉、60ml浓硝酸和180ml浓硫酸依次加入到250ml反应瓶中，在100%功率下超声2h；

（2）将上述溶液在120°c条件下回流24h，将混合物用超纯水稀释到800ml，得到深棕色溶液，用na2co3中和溶液ph为7左右，经浓缩过滤除去大部分钠盐，将滤液分批次在1000da透析袋中透析3天，透析袋中的产物即为gqds，将gqds分散到超纯水中备用。

通过透射电子显微镜（tem）、红外光谱、紫外-可见吸收以及荧光光谱等手段对制备的gqds进行表征。由图1a可见，本发明方法合成的gqds呈纳米点状，形貌均一，分散性好，大小均匀。对gqds的粒径分布进行了统计，gqds的粒径很小，分布范围窄，大部分粒子的粒径分布在2.2nm-3.8nm范围内（图1b）。采用红外光谱对gqds表面基团进行表征，由图2a可见，在3457cm^-1处出现了-oh的伸缩振动，1636cm^-1处出现了coo^–的伸缩振动，1056cm^-1处的吸收峰对应于coh/coc基团中的c-o伸缩振动，以上结果表明，本方法合成的gqds表面含有大量羟基和羧基官能团，使得gqds有良好的水溶性。图2b为gqds的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，gqds分别在228nm和280nm处有紫外吸收峰，228nm处的吸收峰源于c=c键的π-π*跃迁，280nm处的吸收峰对应于c=o键的n-π*跃迁。由荧光光谱可见，gqds的最佳激发波长和最佳发射波长分别为270nm和456nm，斯托克斯位移为186nm，具有良好的荧光性能。以上结果表明，本方法制备的gqds表面富含羟基和羧基等含氧官能团，并具有形貌规整、粒径均匀、水溶性和荧光性能好等特点。

实施例2

gqds与er³⁺以及凝血酶的相互作用机制

以tris-hcl缓冲溶液配置gqds、gqds/er³⁺、gqds+tb和gqds/er³⁺+tb溶液，加入超纯水使测试溶液总体积至200μl，振荡摇匀，测量激发波长为270nm时溶液的荧光光谱，tris-hcl缓冲溶液的最终浓度为50mm且ph为7.0，gqds为12.5μg/ml，er³⁺为15μm，tb为20nm。由图3可见，gqds在456nm有强发射峰（曲线a）；当向gqds中加入er³⁺后，gqds的荧光大大降低（曲线b）；当向gqds与er³⁺的混合溶液中加入tb时，gqds的荧光增强（曲线d）；而向gqds溶液中加入tb时，gqds的荧光不变（曲线c）。

采用动态光散射光谱对gqds与er³⁺之间的相互作用进行表征（图4a），gqds的动态光散射强度较小，当向gqds中加入er³⁺后，动态光散射强度随着er³⁺浓度的增加而逐渐增强，表明gqds与er³⁺配位生成了gqds/er³⁺复合物而使得gqds发生聚集而颗粒增大。当向gqds/er³⁺中加入不同浓度的凝血酶后，动态光散射强度随着凝血酶浓度的增加而逐渐下降（图4b），且光散射强度的降低程度与凝血酶浓度在0.1-3.5nm范围内呈线性关系（r²=0.991），表明随着凝血酶浓度的增加，gqds的聚集程度减小。荧光光谱和动态光散射光谱的结果表明，gqds可与er³⁺发生配位结合形成gqds/er³⁺复合物使得gqds聚集而荧光减弱，当凝血酶存在时，凝血酶与er³⁺之间发生强配位结合，导致gqds从gqds/er³⁺复合物中脱离而分散到溶液中，使得gqds荧光恢复，根据gqds荧光恢复的程度，可以用来确定凝血酶的浓度。

实施例3

gqds/er³⁺复合物荧光纳米探针用于检测tb

将10μl0.25mg/ml的gqds溶液、20μl150μm的er³⁺溶液、20μl50mmph7.4的tris-hcl缓冲溶液与不同浓度的凝血酶溶液混合，加入超纯水使测试溶液总体积至200μl，振荡摇匀，测量激发波长为270nm时溶液的荧光光谱。由图5可见，随着tb浓度的增大，gqds的荧光逐渐增强，且gqds的荧光强度与tb浓度在0.1-6nm范围内呈良好的线性关系，线性相关系数r²=0.993，对tb的检测限为0.049nm，可实现tb的灵敏检测。

实施例4

考查了gqds/er³⁺复合物荧光纳米探针对tb检测的选择性。由图6可见，只有凝血酶才能使gqds荧光显著恢复，而其他蛋白质如牛血清蛋白（bsa）、血红蛋白（hb）、辣根过氧化物酶（hrp）、伴刀豆球蛋白（cona）、溶菌酶（lyso）和老鼠免疫球蛋白igg均不能使gqds荧光恢复。以上结果表明，本发明构建的gqds/er³⁺复合物荧光纳米探针对凝血酶检测具有良好的选择性。