高稳定性的PD-L1抗体试剂及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及了一种pd-l1免疫组化试剂盒。
背景技术：
：肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居肿瘤收尾，且有逐年上升的趋势。非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)占肺癌总数80-85％左右，约75％的患者发现时已处于中晚期，平均生存期12.9个月，3年、5年生存率较低，分别为19％及11％。目前非小细胞肺癌的治疗方式主要包括手术治疗、化疗、放疗及分子靶向治疗。手术治疗仍然是可能治愈患者的唯一治疗方式，然而许多非小细胞肺癌患者发现时往往已经丧失了手术机会。近年来，nsclc的治疗特别是药物治疗(如分子靶向治疗)取得了一定进展，但治愈患者的5年生存率并未有显著改善，寻找有效的治疗手段迫在眉睫。近年来，肿瘤的免疫治疗成为继分子靶向治疗之后的新热点，随着肿瘤免疫学机制研究的深入，一些免疫治疗方法引入临床，但大多还处于探索阶段，对治疗肿瘤仍有限。因此对肿瘤免疫机制的深入研究，了解肿瘤发生和发展规律，为寻找更有效的治疗方法具有重要意义。通过对肿瘤免疫耐受和逃逸机制的广泛而深入的研究发现，参与机体免疫调节的协同刺激分子的表达异常在肿瘤的免疫逃逸中扮演着重要角色。其中，程序性死亡因子1(programmeddeath-1，pd-1)及其配体程序性死亡因子1配体1(programmeddeathligand-1，pd-l1)作为cd28/b7协同刺激分子超家族的成员，可以介导负性协同刺激信号，能有效抑制t、b细胞的功能和增殖，同时减少细胞因子il-2、il-10和ifn-γ的分泌，该抑制途径参与的免疫调节在肿瘤免疫逃逸、肿瘤微环境形成中起到了重要的作用，与肿瘤的发生和发展密切相关。阻断pd-1/pd-l1通路能够抑制肿瘤微环境的形成并且增强内源性的抗肿瘤免疫应答。目前处于临床试验阶段的pd-1/pd-l1抑制剂有很多，2015年3月，pd-1抑制剂nivolumab已经率先被fda批准并用于治疗在经铂为基础化疗期间或化疗后发生疾病进展的转移性鳞性非小细胞肺癌。有研究显示，肿瘤组织中pd-l1的表达与nsclc患者接受免疫治疗的有效性相关，也与nsclc患者的不良预后和高侵袭性密切相关。因此检测nsclc组织中pd-l1的表达可辅助nsclc患者用pd-1/pd-l1抑制剂疗效预测。如何准确、快速的检测出非小细胞肺癌组织中pd-l1蛋白的表达情况是辅助预测pd-1/pd-l1抑制剂疗效的关键因素。目前，检测pd-l1的表达情况主要采用的方法有测序法、实时定量pcr法及组织免疫组化法等方法。这些方法各有优劣，但测序法、实时定量pcr法存在操作复杂、耗时长、成本相对较大、等不足之处，而免疫组化法操作简单、耗时短、成本相对较少有利于检测非小细胞肺癌组织中pd-l1的表达情况。组织免疫组化的方法，使用到的试剂主要包括与组织中需检测的蛋白特异性结合的一抗、二抗和显色剂。传统试剂中的一抗需在较高浓度时、于-20℃甚至更低温度储存，才能维持较高的稳定性。因此，一般免疫组化实验中使用到的一抗试剂或试剂盒，应在孵育一抗前，将一抗从-20℃取出，待溶解并混合均匀后，使用pbs或类似抗体稀释液将一抗稀释至工作浓度，立即使用。因此，传统的用于免疫组化或其他免疫学实验的一抗试剂存在需于-20℃低温储存，且使用前还需稀释步骤，储存和取用较不方便的问题。同时，于-20℃储存用时需溶解，反复冻融会使抗体稳定性变差，易导致效价下降的问题。因此，有必要提供一种已稀释至工作浓度并可以于0℃以上储存、且稳定性好，可以即取即用的pd-l1单克隆抗体试剂。技术实现要素：基于此，本发明的目的在于提供一种已稀释至工作浓度并可以于0℃以上储存、且稳定性好，可以即取即用的pd-l1单克隆抗体试剂。为了实现上述目的，提供具体技术方案如下：一种高稳定性的pd-l1抗体试剂，包括有鼠抗人pd-l1单克隆抗体和抗体稳定剂，所述抗体稳定剂选自：peroxidasestabilizingbuffer,sigma-p9209；所述鼠抗人pd-l1单克隆抗体选自：pd-l1monoclonalantibody，thermofisher：14-5983-80。在其中一些实施例中，所述鼠抗人pd-l1单克隆抗体在所述抗体稳定剂中的浓度为0.4-0.8μg/ml。在其中一些实施例中，所述鼠抗人pd-l1单克隆抗体在所述抗体稳定剂中的浓度为0.4μg/ml。本发明的目的还在于提供一种上述高稳定性的pd-l1抗体试剂的应用。为实现上述目的，具体技术方案如下：上述高稳定性pd-l1抗体试剂在制备pd-l1免疫组化试剂盒中的应用。本发明的目的还在于提供一种pd-l1免疫组化试剂盒。为实现上述目的，具体技术方案如下：一种pd-l1免疫组化试剂盒，包括有上述高稳定性pd-l1抗体试剂。在其中一些实施例中，该试剂盒还包括有hrp-羊抗小鼠igg，可与鼠抗人pd-l1单克隆抗体结合。在其中一些实施例中，该试剂盒还包括有内源性过氧化物酶阻断剂和封闭液。本发明还提供一种上述免疫组化试剂盒的应用。具体方案如下：上述试剂盒在制备预测pd-l1抑制剂疗效的检测试剂中的应用。上述试剂盒在制备预测非小细胞肺癌治疗效果的产品中的应用。相对于现有技术，本发明具有如下优点和效果：本发明通过发明人的创造性劳动，在众多抗体及抗体稳定剂中筛选并使用了peroxidasestabilizingbuffer,sigma-p9209；作为抗体稳定剂，用于稀释pd-l1monoclonalantibody，thermofisher：14-5983-80单克隆抗体，通过抗体稳定剂和pd-l1单克隆抗体的两者的合理选择与搭配，抗体经peroxidasestabilizingbuffer,sigma-p9209稀释至相应的工作浓度后，可于4℃保存且稳定性高，从而实现即取即用，达到了储存及取用方便的目的，同时，避免了于-20℃储存时需反复冻融导致的抗体效价降低。本发明另一方面发现，将抗体稀释至不同浓度时，其储存稳定性也具有差异，选择得到0.4-0.8μg/ml的浓度作为工作浓度，该浓度下抗体稳定性高，且免疫组化试验染色效果佳。同时，特定浓度且即取即用的抗体试剂，无需每次使用前临时配制，不但能解决免疫组化实验时抗体的现配现用方法中取用不方便的问题，同时还能避免每次配制时浓度的差异带来的误差。另外，本发明提供的试剂盒，使用上述高稳定性抗体，一方面其包含的单克隆抗体能够特异性识别pd-l1，试剂盒储存方便，另一方面对免疫组化检测pd-l1时所需试剂进行了整合，使pd-l1的免疫组化检测更直观、更方便快捷。附图说明图1为实施例1中nsclc患病肺部组织的染色结果；图2为实施例1中正常肺组织的染色结果；图3为使用sigma的peroxidasestabilizingbuffer(p9209)稀释的抗体进行免疫组化实验染色结果；图4为使用candorbioscience的antibodystabilizerpbs(131500)稀释的抗体进行免疫组化实验染色结果；图5为使用hrp-stab(270500)稀释的抗体进行免疫组化实验染色结果；图6为抗体现配现用时进行免疫组化实验染色结果；图7为使用pbs稀释的抗体进行免疫组化实验染色结果；图8为由r&d购置的抗pd-l1抗体免疫组化实验染色结果；图9为本发明所述抗体以1:5000比例稀释后进行免疫组化实验染色结果；图10为本发明所述抗体以1:8000比例稀释后进行免疫组化实验染色结果；图11为本发明所述抗体以1:10000比例稀释后进行免疫组化实验染色结果；图12为本发明所述抗体以1:15000比例稀释后进行免疫组化实验染色结果；图13为实施例4中pd-l1一抗孵育时间对免疫组化检测效果的影响结果；图14为实施例5中二抗孵育时间对免疫组化检测效果的影响结果。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，并不限制本发明地范围。实施例1：pd-l1免疫组化试剂盒用于检测nsclc组织切片中pd-l1的表达本实施例提供一种检测pd-l1的免疫组化试剂盒及其应用，该试剂盒包括如下试剂：内源性过氧化物酶阻断剂，3％(v/v)的h2o2溶液；高稳定性抗体试剂：鼠抗人pd-l1抗体pd-l1monoclonalantibody，(thermofisher：14-5983-80)，已由peroxidasestabilizingbuffer稀释至0.5μg/ml；hrp-羊抗小鼠igg，购买于迈新生物技术开发有限公司，kit-0014；封闭液，磷酸盐缓冲液pbs作为溶剂配制的5％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)溶液；dab显色液，购买于迈新生物技术开发有限公司。所述试剂盒的检测原理如下：利用免疫学抗原与抗体基于两者分子间的结构互补性和高度亲和性能够特异性结合，通过氧化还原反应使标记抗体的酶显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性。首先是连接抗人pd-l1抗体和组织上的pd-l1抗原；第二是hrp-羊抗小鼠igg聚合物识别已经连接上的抗人pd-l1抗体；第三是加入显色底物，聚合物上的辣根过氧化物酶可以催化dab显色液中的h2o2分解，使联苯胺氧化成联苯亚胺，从而使组织切片中抗原位点上显现黄色或棕黄色着色；最后对样本进行复染和封片。通过显微镜观测显色情况，推断组织切片上pd-l1的存在位点和情况。从医院病理科获取甲醛固定石蜡包埋的组织切片两张，经过病理诊断，一张为正常肺组织，另一张确诊为nsclc组织，用于测定pd-l1蛋白表达。先对组织切片进行脱蜡水化：切片二甲苯脱蜡三次，每次10分钟，梯度酒精脱水，无水乙醇两次，每次5分钟，95％乙醇中5min，75％乙醇中5min，pbs溶液中5分钟。免疫组化染色步骤如下：1、抗原修复将组织切片置于煮沸的1mmedta抗原修复溶液中(ph＝9.0)，微波炉中低火加热10min，自然冷却至室温。注意抗原修复时修复液的量必须保证切片始终浸泡在液体内，加热完冷却至室温过程中切片必须始终保持在液体内，不可将切片取出在空气中冷却。2、阻断内源性过氧化物酶1)将抗原修复后的组织切片用pbs冲洗3次，每次5分钟；2)取出切片，甩掉并擦干组织周围液体，免疫组化笔圈定爬片上的待测区域；3)在待测区域内滴加3％的h2o2，室温放置15min以灭火内源性辣根过氧化物酶。4)pbs溶液冲洗3次，每次5分钟。3、封闭在细胞爬片上滴加封闭液，至覆盖待测区域，室温放置30min后，甩去多余液体。4、pd-l1抗体孵育1)去除pbs溶液，加入按不同稀释倍数稀释的pd-l1抗体试剂，室温孵育60分钟；2)pbs溶液冲洗3次，每次5分钟。5、酶标聚合物孵育1)去除pbs溶液，加入100μlhrp标记hrp-羊抗小鼠igg工作液，室温孵育30分钟；2)pbs溶液冲洗3次，每次5分钟。6、dab显色在配备的小试管中依次滴加稳定型dab缓冲液1ml，稳定型dab底物50-100μl，稳定型dab色原50-100μl，以配制dab显色液，混匀，避光。混匀后加至切片。室温显色，镜下控制显色时间，一般5-10分钟。蒸馏水洗涤终止反应。如有必要，可进行苏木素复染：切片上滴加苏木素染液，孵育1-2min，之后用蒸馏水洗涤。注意：依据作用的苏木素染色液的强度和孵育时间的长短：对比染色结果导致细胞核呈现淡蓝到深蓝颜色的反应，而过染或是不足染色都有可能危及正确结果的判断。7、脱水、透明、封片分别置75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯中，浸泡5分钟；滴加中性树脂，盖玻片封片。8、生物显微镜阅片及结果判断染色结果见图1和图2。其中，图1为nsclc患病肺组织的染色结果，pd-l1着色为棕色部分，蓝色部分为细胞核；图2为正常肺组织的染色结果，仅细胞核部分着色为蓝色。在图2正常肺组织中无任何棕色着色，因正常肺组织中无pd-l1表达，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图13中棕色部分即为pd-l1阳性着色，pd-l1主要表达在肿瘤组织肿瘤细胞的细胞膜中，并且可以看到棕色着色大部分围绕蓝色的细胞核分布。而正常的免疫细胞中则没有pd-l1棕色着色，是正常的阴性结果，同样没有出现假阳性和假阴性。表明pd-l1呈特异性分布在nsclc组织肿瘤细胞胞膜中，呈强阳性着色分布，本试剂盒可有效检测nsclc组织中的pd-l1。实施例2:抗体稳定剂对抗体稳定性影响研究用sigma的peroxidasestabilizingbuffer(货号p9209)、candorbioscience的antibodystabilizerpbs(货号：131500)和hrp-stab(货号：270500)分别作为抗体稳定剂稀释鼠抗人pd-l1monoclonalantibody，(thermofisher：14-5983-80)，稀释为0.4μg/ml，采用加速稳定性试验测试各抗体稳定剂稳定单克隆抗体效价的能力。稀释的一抗置于37℃保存，分别在0天、4天、7天、9天利用迈新dab检测试剂盒分别对b-cpap和mcf-7细胞进行免疫组化检测，对比染色效果。将pbs稀释的鼠抗人pd-l1monoclonalantibody，(thermofisher：14-5983-80)分别37℃保存0、4、7、9天，以及在同一天以pbs稀释、现配现用鼠抗人pd-l1monoclonalantibody，(thermofisher：14-5983-80)分别作为对照。上述均稀释为0.4μg/ml。免疫组化试验步骤同实施例1。对其进行半定量分析，将染色标记免疫特征分为三级，即弱(1+)、中(2+)、强(3+)。结果如图8-图11示，其对应的半定量分析结果如表1示。表1如图3-7，图3为使用peroxidasestabilizingbuffer(货号p9209)稀释的抗体，在37℃放置0、4、7、9天后，对b-cpap细胞和mcf-7细胞进行免疫组化试验的结果；图4为使用candorbioscience的antibodystabilizerpbs(货号：131500)在37℃放置0、4、7、9天后，对b-cpap细胞和mcf-7细胞进行免疫组化试验的结果；图5为使用hrp-stab(货号：270500)在37℃放置0、4、7、9天后，对b-cpap细胞和mcf-7细胞进行免疫组化试验的结果；图6为第0、4、7、9天时，当天从-20℃取出未稀释的抗体，以pbs稀释8000倍后，对b-cpap细胞和mcf-7细胞进行免疫组化试验的结果；图7为使用pbs稀释的抗体，在37℃放置0、4、7、9天后，对b-cpap细胞和mcf-7细胞进行免疫组化试验的结果；其中a表示b-cpap细胞，b表示mcf-7细胞，1-4分别对应第0、4、7、9天的实验结果。染色结果显示：由于pd-l1在b-cpap细胞中高表达，而在mcf-7细胞中不表达，图3-8中的mcf-7细胞均无明显棕色着色，有效排除假阳性结果。在b-cpap的结果中，使用sigma的peroxidasestabilizingbuffer(货号p9209)，染色效果可达2-3+；而在用前将pd-l1抗体从-20℃冰箱中取出并稀释为0.4μg/ml，用于免疫组化实验，染色效果也为2-3+；可见，第0、4、7、9天时，两者效果均未有明显差异。因此，peroxidasestabilizingbuffer稀释得到的pd-l1抗体具有稳定性。实施例3：抗体浓度对免疫组化检测效果的影响按不同的浓度分别对进行稀释：实施例1所述pd-l1抗体母液为0.5mg/ml浓度，用peroxidasestabilizingbuffer(货号p9209)分别稀释成浓度分别为：0.8μg/ml、0.6μg/ml、0.4μg/ml和0.2μg/ml。以上述4个浓度的抗体溶液及r&d购置的抗人pd-l1抗体(货号为mab1561)为对照，室温下放置第0、4、7、9天时，用于免疫组化实验，测定其效果。本实施例以培养的甲状腺癌细胞系b-cpap和人乳腺癌细胞系mcf-7甲醛固定石蜡包埋的组织切片为样本，使用迈新dab试剂盒进行免疫组化试验，测试pd-l1单克隆抗体的效价，找到最适用于免疫组化的抗体工作浓度。免疫组化步骤同实施例1。显微镜下观察切片染色效果，对其进行半定量分析，将染色标记免疫特征分为三级，即弱(1+)、中(2+)、强(3+)。其对应的半定量分析结果如表2所示。表2如图8-12，图8为由r&d购置的pd-l1抗体，货号：mab1561，以商家推荐的用于免疫组化实验的浓度为15ug/ml的一抗溶液，进行免疫组化试验，作为对照组的结果图。图9为0.8μg/ml的本发明所述pd-l1抗体，图10为0.6μg/ml的本发明所述pd-l1抗体，图11为0.4μg/ml的本发明所述pd-l1抗体，图12为0.2μg/ml的本发明所述pd-l1抗体，作为一抗溶液，进行免疫组化实验的结果图。其中，a为b-cpap细胞的染色结果，b为mcf-7细胞的染色结果，a1、a2、a3、a4或b1、b2、b3、b4指在室温放置第0、4、7、9天的pd-l1抗体作为一抗的实验结果图。将本发明的pd-l1单克隆抗体与抗体稳定剂分别稀释成浓度为：0.8μg/ml、0.6μg/ml、0.4μg/ml和0.2μg/ml，作为一抗溶液，以从r&d购买的抗体作为对照组，进行免疫组化试验的结果中可知：在稀释后放置第0天(即现配现用)时，四个浓度及从r&d购买的抗体免疫组化试验效果相当，而在稀释后该浓度放置第4天时，0.2μg/ml浓度的抗体用于免疫组化实验时，阳性细胞b-cpap的着色较弱，因此，在该浓度下，抗体的稳定性较低。因此，在0.4-0.8μg/ml的浓度下，抗体稳定性高，且免疫组化实验染色效果好，且效果明显优于有r&d购买得到的抗体，说明本发明的pd-l1单克隆抗体可在工作浓度0.4μg/ml-0.8μg/ml下保存，且稳定性高。实施例4：pd-l1一抗孵育时间对免疫组化检测效果的影响本实施例以培养的甲状腺癌细胞系b-cpap和人乳腺癌细胞系mcf-7甲醛固定石蜡包埋的组织切片，分为3组，分别置于室温中进行一抗孵育不同时间，其中b-cpap细胞用于检测pdl1蛋白表达，mcf-7因不表达pd-l1用于阴性对照。按实施例1免疫组化操作步骤检测pd-l1，其中孵育pd-l1一抗时，3组分别室温孵育0.5、1、2小时。显微镜下观察切片染色效果，对其进行半定量分析，将染色标记免疫特征分为三级，即弱(1+)、中(2+)、强(3+)。其对应的半定量分析结果如表3所示。分组b-cpap细胞mcf-7细胞室温孵育0.5h1+<1+室温孵育1h2+～3+<1+室温孵育2h2+～3+1+表3染色结果如图13所示，其中a1-a3分别表示b-cpap细胞的在0.5h、1h、和2h的染色结果，b1-b3分别表示mcf-7细胞在0.5h、1h、和2h的染色结果，根据图中显示：一抗室温孵育0.5小时阴性对照mcf-7细胞中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性，b-cpap细胞上pdl1单克隆抗体免疫染色结果弱，一抗室温孵育1小时阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性，pdl1单克隆抗体免疫染色有明显的棕色着色，一抗室温孵育2小时阴性对照中出现微弱的棕色着色，表明有非特异性背景着色即假阳性。表明一抗孵育时间对pdl1的免疫着色具有明显的影响。实施例5：二抗孵育时间对免疫组化检测效果的影响本实施例以培养的甲状腺癌细胞系b-cpap和人乳腺癌细胞系mcf-7甲醛固定石蜡包埋的组织切片，分为3组，分别置于室温中进行一抗孵育不同时间，其中b-cpap细胞用于检测pdl1蛋白表达，mcf-7因不表达pd-l1用于阴性对照。按实施例1免疫组化操作步骤检测pd-l1，其中孵育酶标二抗时，3组分别室温孵育15、30、60min。显微镜下观察切片染色效果，对其进行半定量分析，将染色标记免疫特征分为三级，即弱(1+)、中(2+)、强(3+)。其对应的半定量分析结果如表4所示。分组b-cpap细胞mcf-7细胞室温孵育15min1+<1+室温孵育30min2+～3+<1+室温孵育60min2+～3+1+表4染色结果如图14所示，其中a1-a3分别表示b-cpap细胞的在15min、30min、和60min的染色结果，b1-b3分别表示mcf-7细胞在15min、30min、和60min的染色结果，根据图中显示：二抗室温孵育15分钟阴性对照mcf-7细胞中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性，pdl1单克隆抗体免疫染色结果弱，二抗室温孵育30分钟阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性，pdl1单克隆抗体免疫染色有明显的棕色着色，二抗室温孵育60分钟阴性对照中出现微弱的棕色着色，表明有非特异性背景着色即假阳性。表明二抗孵育时间对pdl1的免疫着色具有明显的影响。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12