本发明涉及体外诊断试剂技术领域，更具体的说是涉及一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法。
背景技术：
胶乳免疫比浊试剂中，灵敏度高低，直观的表现为吸光度信号值变化率高低及其测试重复稳定性，可以间接的通过最低检测限lod来表述，即lod越低，灵敏度越高。
目前，常规提高胶乳比浊检测试剂灵敏度的方法包括提高试剂中增敏剂含量、提高胶乳粒径、使用长空间臂胶乳、增大样本量以及使用更高亲和力抗体。虽然提高试剂中增敏剂含量简单易用，提高灵敏度效果明显；但增敏剂常选用聚乙二醇，吐温-20和曲拉通100系列等，聚乙二醇系列浓度过高引起非特异性沉淀，假阳性；吐温-20和曲拉通100系列浓度与灵敏度关系成钟型，低浓度时随浓度其增加，试剂灵敏度提高，过高浓度时，降低试剂灵敏度。提高胶乳粒径：大粒径胶乳能够有效增加吸光度信号值，成倍提高试剂灵敏度，但是会导致试剂空白过高，而且大粒径胶乳通常会降低试剂线性范围和抗原过剩能力，且大粒径胶乳生产工艺更难控制，试剂存储稳定性也是难题。使用长空间臂胶乳：空间位阻，以及偶联在胶乳表面抗体的自由度，影响抗原抗体结合的难易，从而影响试剂灵敏度；虽然商业化的长链羧基胶乳也供应较多，但偶联过程相对常规羧基胶乳容易凝聚，放大工艺较为困难。增大样本量：在试剂不变情况下，提高样本量能成倍提升试剂灵敏度，但是牺牲线性及抗原过剩范围，且增大基质效应和干扰物浓度，导致测定不准确。使用更高亲和力抗体：亲和力高，能够更快更牢固的结合抗原，从而提高吸光度信号变化率及其重复稳定性。但著名品牌商业化的抗体，均经过了长期亲和力改进，亲和力再提高困难。
因此，如何能够独立于现有技术外，再提高胶乳比浊试剂的灵敏度是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，该方法既能够提高试剂质量：最低检测限lod低且重复性好，还能降低试剂成本：使用更少的抗体即可达到相同灵敏度。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，具体步骤如下：
(1)将双链单特异性抗体与羧基胶乳共价偶联，在封闭前的胶乳溶液中加入尿素，使胶乳溶液中尿素终浓度达到10-20mm/l；37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育1小时，断裂抗体两条重链以及轻链和重链间的二硫键，获得胶乳试剂；
(2)将中部酸性，两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架，室温溶解于支架溶解液中；所述氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架；
所述氨基酸支架序列如式ⅰ所示，k为赖氨酸，c为半胱氨酸，x为3-4个自由组合的酸性氨基酸；
环肽中部较强的酸性极性，有利于避免氨基酸支架介入到轻链和重链间的二硫键形成，在氨基酸支架不严重过量时，其较少的介入到轻链与重链间二硫键。x过长，可能由于位阻问题，使其嵌入重链间的效率不高；还会引起抗体结构破坏，部分变性失活，灵敏度提升不够，不如3和4个氨基酸。x短，极性不强，导致大量氨基酸支架参与轻链与重链间二硫键桥接，而抗体重链fab间氨基酸支架不足，并且x端距离扩展不够大，灵敏度提升不如3-4个氨基酸。
(3)对步骤(1)获得的胶乳试剂去除50％背景缓冲液，即换液50％；加入步骤(2)所述溶解有氨基酸支架的溶液，使每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架并混匀；向前述混合有氨基酸支架胶乳试剂中滴加50mmol/l的过硫酸钾溶液，所述过硫酸钾的摩尔量为步骤(1)中尿素量的35-50％；
(4)将步骤(3)滴加了过硫酸钾溶液的胶乳试剂于37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；重新形成二硫键，在抗体两条重链间增加了空间支架，增大抗体两个fab之间的空间距离；部分轻链与重链间也会加入支架，对灵敏度提升影响不大；
(5)将步骤(4)孵育后的胶乳试剂进行封闭并换液清洗去除残留氨基酸支架、尿素和过硫酸钾，制得成品试剂r2。
优选地，步骤(1)所述胶乳溶液中尿素终浓度为20mm/l。
优选地，步骤(2)所述支架溶解液为100mm/lph7.5，含0.1％v/v吐温-20的pbs缓冲液。
优选地，步骤(2)所述氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.015mg氨基酸支架。
优选地，步骤(2)所述酸性氨基酸为天冬氨酸d和/或谷氨酸e。
优选地，步骤(2)所述x为ddd，eee，ded，ede，edd，dde，eed，dee，dddd，eddd，dedd，dded，ddde，eedd，eeed，eeee，ddee，dede，deee，edee，eede，eded，deed或edde。
优选地，步骤(3)所述换液方法为离心、透析、层析柱或超滤换液。
小规模换液采用离心换液，大规模换液采用超滤和层析柱。
优选地，步骤(3)所述过硫酸钾的摩尔量为步骤(1)中尿素量的50％。
优选地，步骤(3)所述50mmol/l过硫酸钾溶液为用200ml支架溶解液溶解2.7032g过硫酸钾得到。
优选地，步骤(5)所述封闭并换液清洗的具体步骤如下：将步骤(4)孵育后的胶乳试剂，22000rpm离心15min，去上清，加入适量(依赖于不同项目成品所需要胶乳浓度，通常为1-4g/l的胶乳终浓度)封闭清洗液复溶，室温混匀2小时，制得成品试剂r2。
优选地，所述封闭清洗液为100mm/lph7.5的pbs缓冲液，含0.1％v/v吐温-20，1g/lbsa，0.05％v/v防腐剂pc300。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，通过在偶联于羧基胶乳表面的抗体两条重链间，增加一个氨基酸支架，来增加抗体两个fab之间的空间距离，从而减小胶乳比浊过程中抗体与抗原结合的空间位阻，提高灵敏度；本发明对采用常规羧基胶乳偶联抗体后的试剂进行改进，放大工艺成熟，利于推广。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
配制200mm/l，300mm/l，400mm/l，500mm/l的尿素水溶液各100ml，室温备用。
配制支架溶解液：100mm/lph7.5，含0.1％v/v吐温-20的pbs缓冲液，室温备用。
配制50mm/l过硫酸钾溶液：即使用支架稀释液200ml溶解2.7032g过硫酸钾，4℃存放备用。
配制封闭清洗液：100mm/lph7.5pbs缓冲液，含0.1％v/v吐温-20，1g/lbsa，0.05％v/v防腐剂pc300，室温备用。
多克隆抗体反应缓冲液试剂1-pab(r1-pab)：100mm/lph7.5pbs缓冲液，含0.5％v/v吐温-20，0.05％v/v防腐剂pc300，终浓度350mm/l氯化钠，终浓度10g/l聚乙二醇6000，终浓度2ml/lscantibody公司阻断剂hbr22，室温备用。
单克隆抗体反应缓冲液试剂1-mab(r1-mab)：100mm/lph7.5pbs缓冲液，含0.5％v/v吐温-20，0.05％v/v防腐剂pc300，终浓度150mm/l氯化钠，终浓度15g/l聚乙二醇6000，终浓度5ml/lscantibody公司阻断剂hbr1，室温备用。
实施例1
肌红蛋白mb项目，进口兔多克隆抗体，离心方式换液，与对照未改造试剂进行比较，同时比较尿素用量影响
(1)胶乳清洗(免洗的日本jsr公司胶乳可不经过此步骤)：使用100mm/l的mes-naoh缓冲液，ph5.5，离心换液胶乳微球2次；取10ml，10％质量浓度的安捷伦pl6115138nm胶乳微球22000rpm离心15min，去上清，使用10ml上述缓冲液复溶，然后再离心，去上清复溶，完成清洗备用；
(2)胶乳活化：以10ml上述清洗过的胶乳为例，称取50mgnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)，30mgedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，用5ml上述清洗用的缓冲液溶解后，取1ml加入10ml已清洗微球中，室温磁力搅拌混匀10min；
(3)活化后清洗：将步骤(2)活化后的胶乳22000rpm离心15min，去上清，加入20ml100mm/lph7.5的pbs缓冲液复溶备用；
(4)抗体偶联：取dako公司货号为oa044的肌红蛋白抗体2ml(12mg/ml)，加入到上述用pbs缓冲液复溶的已活化胶乳溶液中，室温磁力搅拌3小时，完成抗体偶联；
(5)r2改造：
1)将完成抗体偶联的胶乳平均分成5份，每组4ml(命名为a/b/c/d/e组)，多余的废弃(2ml抗体加入到20mlpbs中，由于不同液体互溶原理，终体积仅比20ml略多一点点，并不是得到22ml溶液)；
2)a组为对照组，b组尿素终浓度10mm/l，c组尿素终浓度15mm/l，d组尿素终浓度20mm/l，e组尿素终浓度25mm/l；
具体操作：a组加入安慰剂200ul纯化水，b/c/d/e组分别加入200ul200mm/l，300mm/l，400mm/l，500mm/l的尿素水溶液，即b/c/d/e组对应尿素终浓度为10/15/20/25mm/l；
3)a，b，c，d，e组分均22000rpm15min离心，a组去全部上清，b/c/d/e组去2ml上清，即“换液50％”；
4)将x序列为eded的氨基酸支架(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)1mg溶解于20.8ml支架溶解液中，可以计算得到每组实验中，抗体的质量约为2*12*4/20＝4.8mg；
b/c/d/e组各加入2ml溶解有氨基酸支架的溶液，复溶，可以计算得抗体与支架的用量为1mg抗体对应0.020mg氨基酸支架；
5)b/c/d/e组分别加入50mm/l过硫酸钾溶液0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，即过硫酸钾摩尔量约为步骤2)中尿素量的50％。
6)b/c/d/e组37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；
(6)封闭及清洗：
a组加入封闭清洗液8ml复溶，将b/c/d/e组22000rpm离心15min后去全部上清，加入封闭清洗液8ml复溶，室温混匀2小时备用，即为成品r2。
(7)上机测试
仪器：日立7180，上机参数，样本量6ul，180ul前述配制的r1-pab，60ulr2，570/800nm双波长，两点终点法，18-34读点计算δabs(吸光度变化值)；
使用柏荣诊断mb校准品(s120ng/ml，s2100ng/ml，s3200ng/ml，s4400ng/ml)，零点使用生理盐水，将s1使用生理盐水稀释至5ng/ml，7.5ng/ml，10ng/ml，15ng/ml连同s1，用于最低检测限测试；
测试方案：使用a/b/c/d/e组分别配套上述预先准备的相同r1-pab，相同参数，相同校准品定标，比较各校准点δabs，同时分别测定5ng/ml，7.5ng/ml，10ng/ml，15ng/ml连同s1各10次，分别计算均值，stdev，使用stdev/均值得到精密度cv；注意，测试时从高浓度开始，精度太差，则不测更低浓度，n/a表示。
各实验组定标数据如下：
从定标数据可以看出，相比于对照组，b/c/d/e组灵敏度δabs均有不同程度的提高，其中d组提高幅度最明显，相比对照提升约148％，b/c/d/e组对应尿素终浓度为10/15/20/25mm/l；结果表明，随尿素浓度提高，灵敏度提升先上升后下降，较优的尿素浓度为20mm/l。
各实验组检测限实验如下：
结果可以看出，检测限lod(cv20％处的样本浓度)，对照a组在15-20ng/ml之间，估计在16ng/ml左右；b组在7.5-10ng/ml之间，估计约8.5ng/ml左右，c组也在7.5-10ng/ml之间，但是各浓度精密度明显优于b组，估计lod为7.4ng/ml左右，d组最优，lod在5-7.5ng/ml之间，估计为6ng/ml左右，e组相比b/c/d组出现了lod升高，但优于对照a组，lod在10-15ng/ml之间，估计在10ng/ml左右；结果可以看出，较优的d组，lod下降到对照a组的约37.5％，b组下降到对照组的53.1％，c组下降到对照组的46.3％，d组下降到对照的62.5％；b/c/d/e组对应尿素终浓度为10/15/20/25mm/l，可以看出，随着尿素浓度提高，lod先下降后上升，较优的浓度为20mm/l。
上述结果表明，在尿素浓度10-20mm/l浓度时，在mb项目中，改进试剂r2能够有效提高试剂的检测灵敏度。但尿素不能过量，否则可能造成抗体活性降低，灵敏度提升率下降；尿素量太少，可能导致抗体二硫键断裂不充分，灵敏度提升也不够显著；较优的尿素浓度为20mm/l。
实施例2
甲胎蛋白afp项目，进口兔多克隆抗体，离心方式换液，与对照未改造试剂进行比较，同时比较氨基酸支架用量影响
(1)胶乳清洗：使用100mm/l的mes-naoh缓冲液，ph5.5，离心换液胶乳微球2次；取10ml，10％质量浓度的polymicrospherescb0230d230nm胶乳微球，22000rpm离心10min，去上清，使用10ml上述缓冲液复溶，然后再离心，去上清复溶，完成清洗备用；
(2)胶乳活化：以10ml上述清洗过的胶乳为例，称取50mgnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)，30mgedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，用5ml上述清洗用的缓冲液溶解后，取1ml加入10ml已清洗微球中，室温磁力搅拌混匀10min；
(3)活化后清洗：将步骤(2)活化后胶乳22000rpm离心10min，去上清，加入36ml100mm/lph7.5的pbs缓冲液复溶备用；
(4)抗体偶联：取dako公司货号为a0008的甲胎蛋白抗体15ml(2.5mg/ml)，加入到上述用pbs缓冲液复溶的已活化胶乳溶液中，室温磁力搅拌3小时，完成抗体偶联；
(5)r2改造：
1)将完成抗体偶联的胶乳平均分成5份，每组10ml(命名为a2/b2/c2/d2/e2组)，多余的废弃(15ml抗体加入到36mlpbs中，由于不同液体互溶原理，终体积仅比50ml略多一点点，并不是得到51ml溶液)。
2)a2组为对照组加入安慰剂纯化水400ul，b2/c2/d2/e2组各加入500mm/l的尿素水溶液400ul，至尿素终浓度约20mm/l；
3)a2，b2，c2，d2，e2组分均22000rpm10min离心，a2组去全部上清，b2/c2/d2/e2组去5ml上清，即“换液50％”；
4)将x序列为ded的氨基酸支架(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)1mg溶解于20ml支架溶解液中，可以计算得到每组实验中，抗体的质量约为15*2.5*10/50＝7.5mg；
b2组加入含支架溶液0.75ml，支架溶解液4.25ml，可计算b2组中1mg抗体约对应0.005mg支架；
c2组加入含支架溶液1.5ml，支架溶解液3.5ml，可计算c2组中1mg抗体约对应0.010mg支架；
d2组加入含支架溶液2.25ml，支架溶解液2.75ml，可计算d2组中1mg抗体约对应0.015mg支架；
e2组加入含支架溶液3.0ml，支架溶解液2.0ml，可计算e2组中1mg抗体约对应0.020mg支架；
5)b2/c2/d2/e2组分别加入50mm/l过硫酸钾溶液2.0ml，即过硫酸钾摩尔量约为步骤2)中尿素量的50％；
6)b2/c2/d2/e2组37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min。
(6)封闭及清洗：
a2组加入封闭清洗液10ml复溶，将b2/c2/d2/e2组22000rpm离心后去全部上清，加入封闭清洗液10ml复溶，室温混匀2小时备用，即为成品r2；
(7)上机测试
仪器：日立7180，上机参数，样本量6ul，180ul前述配制的r1-pab，45ulr2，700nm单波长，两点终点法，19-34读点计算δabs；
使用柏荣诊断afp校准品(s110ng/ml，s220ng/ml，s363ng/ml，s4315ng/ml)，零点使用生理盐水，将s1使用生理盐水稀释至1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，7.5ng/ml连同s1，用于最低检测限测试；
测试方案：使用a2/b2/c2/d2/e2组分别配套上述预先准备的相同r1-pab，相同参数，相同校准品定标，比较各校准点δabs，同时分别测定1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，7.5ng/ml连同s1，各10次，分别计算均值，stdev，使用stdev/均值得到精密度cv；注意，测试时从高浓度开始，精度太差，则不测更低浓度。
各实验组定标数据如下：
从定标数据可以看出，相比于对照组，b2/c2/d2/e2组灵敏度δabs均有不同程度的提高，其中d2和e2组提高幅度最明显，相比对照提升约150％，b2/c2/d2/e2组中抗体1mg对应氨基酸支架量为0.005/0.010/0.015/0.020mg；可以看到，随着支架量提高，灵敏度提升先上升后趋于平稳，考虑支架成本，较优的1mg抗体对应支架量约为0.015mg。
各实验组检测限实验如下：
结果可以看出，检测限lod(cv20％处的样本浓度)，对照a2组在5-7.5ng/ml之间，估计在6.7ng/ml左右；b2组在5-7.5ng/ml之间，但是各浓度精密度明显优于a2组，估计约5ng/ml左右，c2组也在2.5-5ng/ml之间，估计lod为3.3ng/ml左右，d2和e2组最优，lod在1-2.5ng/ml之间，估计为2.4ng/ml左右，较优的b2组，lod下降到对照a2组的约74.6％，c2组下降到对照组的49.3％，d2和e2组下降到对照组的35.8％。b2/c2/d2/e2组抗体1mg对应氨基酸支架为0.005/0.010/0.015/0.020mg，可以看到，随着支架浓度提高，lod先下降后趋于平稳0.015和0.020mg效果相差不大，但支架成本较高，考虑成本问题，较优的每mg抗体对应的氨基酸支架的为0.015mg。
上述结果表明，每mg抗体对应的支架量在0.010-0.020mg之间时，在afp项目中，改进方案有效提高试剂的检测灵敏度；考虑成本问题支架不能无限提高，较优的每mg抗体对应氨基酸支架为0.015mg。
实施例3
铁蛋白fer项目，国产兔多克隆抗体，离心方式换液，与对照未改造试剂进行比较，同时比较过硫酸钾浓度影响
(1)胶乳清洗(免洗的日本jsr公司胶乳可不经过此步骤)：使用100mm/l的mes-naoh缓冲液，ph5.5，离心换液胶乳微球2次；取10ml，10％质量浓度的polymicrospherescb0297c297nm胶乳微球使用22000rpm离心6min，去上清，使用10ml上述缓冲液复溶，然后再离心，去上清复溶，完成清洗备用；
(2)胶乳活化：以10ml上述清洗过的胶乳为例，称取50mgnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)，30mgedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，用5ml上述清洗用的缓冲液溶解后，取1ml加入10ml已清洗微球中，室温磁力搅拌混匀10min；
(3)活化后清洗：将步骤(2)活化后胶乳22000rpm离心6min，去上清，加入46ml100mm/lph7.5的pbs缓冲液复溶备用；
(4)抗体偶联：取zenbio公司货号为301067的铁蛋白抗体5ml(13mg/ml)，加入到上述用pbs缓冲液复溶的已活化胶乳溶液中，室温磁力搅拌3小时，完成抗体偶联；
(5)r2改造：
1)将完成抗体偶联的胶乳平均分成5份，每组10ml(命名为a3/b3/c3/d3/e3组)，多余的废弃(5ml抗体加入到46mlpbs中，由于不同液体互溶原理，终体积仅比50ml略多一点点，并不是得到51ml溶液)；
2)a3组为对照组加入安慰剂纯化水400ul，b3/c3/d3/e3组各加入500mm/l的尿素水溶液400ul，至尿素终浓度约20mm/l；
3)a3，b3，c3，d3，e3组分均22000rpm10min离心，a3组去全部上清，b3/c3/d3/e3组去5ml上清，即“换液50％”；
4)将x序列为ede的氨基酸支架(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)1mg溶解于20ml支架溶解液中，可以计算得到每组实验中，抗体的质量约为5*13*10/50＝13mg；
b3/c3/d3/e3组分别加入溶解有支架的支架溶解液各3.9ml，可以计算得知，每mg抗体对应的支架为0.015mg；
5)b3组加入50mm/l浓度过硫酸钾溶液1.0ml，即过硫酸钾mol量为步骤4.2中尿素量的约25％；
c3组加入50mm/l浓度过硫酸钾溶液1.4ml，即过硫酸钾mol量为步骤4.2中尿素量的约35％；
d3组加入50mm/l浓度过硫酸钾溶液1.6ml，即过硫酸钾mol量为步骤4.2中尿素量的约40％；
e3组加入50mm/l浓度过硫酸钾溶液2.0ml，即过硫酸钾mol量为步骤4.2中尿素量的约50％；
6)b3/c3/d3/e3组37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；
(6)封闭及清洗：
a3组加入封闭清洗液12ml复溶，将b3/c3/d3/e3组22000rpm离心后去全部上清，加入封闭清洗液12ml复溶，室温混匀2小时备用，即为成品r2。
(7)上机测试
仪器：日立7180，上机参数，样本量10ul，120ulr1，60ulr2，570nm单波长，两点终点法，18-34读点计算δabs；
使用柏荣诊断fer校准品(s120ng/ml，s2100ng/ml，s3200ng/ml，s4500ng/ml)，零点使用生理盐水，将s1使用生理盐水稀释至5ng/ml，7.5ng/ml，10ng/ml，15ng/ml连同s1，用于最低检测限测试；
测试方案：使用a3/b3/c3/d3/e3组分别配套上述预先准备的相同r1-pab，相同参数，相同校准品定标，比较各校准点δabs，同时分别测定5ng/ml，7.5ng/ml，10ng/ml，15ng/ml连同s1各10次，分别计算均值，stdev，使用stdev/均值得到精密度cv；注意，测试时从高浓度开始，精度太差，则不测更低浓度。
各实验组定标数据如下：
结果可以看出，相比对照a3组，随着过硫酸钾浓度的提高，fer试剂灵敏度δabs显著提升，其中，过硫酸钾浓度相对于尿素浓度50％时，即e3组，灵敏度最高，但是对比e3和d3发现，虽然d3到e3，尿素浓度从40％增长到50％，但是灵敏度提升已经趋缓。且过硫酸钾浓度过高，对于试剂稳定性，以及非特异反应均有不利影响。故较优的过硫酸钾加入浓度约为前面步骤尿素浓度的50％。
以下为实施例3的最低检测限实验数据：
结果可以看出，检测限lod(cv20％处的样本浓度)，对照a3组在10-15ng/ml之间，估计在15ng/ml左右；b3组在10-15ng/ml之间，但是各浓度精密度明显优于a3组，估计约10ng/ml左右，c3组也在7.5-10ng/ml之间，估计lod为7.5ng/ml左右，d3组，lod在7.5-5ng/ml之间，估计为6.5ng/ml左右，较优的d3组，lod在7.5-5ng/ml之间，估计为6.1ng/ml左右，b3组lod下降到对照a2组的约66.7％，c3组下降到对照组的50％，d3和e3组下降到对照组的43.3％和40.7％。b3/c3/d3/e3对应的过硫酸钾浓度分别为前面步骤尿素浓度的25％，35％，40％和50％，可以看到随着过硫酸钾浓度提高，lod呈逐渐下降趋势，但是40％以后趋势放缓。
上述结果表明，在fer项目中，随着过硫酸钾浓度提高，改进方案有效提高试剂的检测灵敏度。且过硫酸钾浓度过高，对于试剂稳定性，以及非特异反应均有不利影响。过硫酸钾较优浓度为前序步骤尿素浓度的50％。
实施例4
d二聚体d-dimer项目，进口鼠单克隆抗体，离心方式换液，与对照未改造试剂进行比较，同时比较x氨基酸数量差异影响；
(1)胶乳清洗(免洗的日本jsr公司胶乳可不经过此步骤)：使用100mm/l的mes-naoh缓冲液，ph5.5，离心换液胶乳微球2次；取10ml，10％质量浓度的安捷伦pl6115138nm胶乳微球，22000rpm离心15min，去上清，使用10ml上述缓冲液复溶，然后再离心，去上清复溶，完成清洗备用；
(2)胶乳活化：以10ml上述清洗过的胶乳为例，称取50mgnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)，30mgedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，用5ml上述清洗用的buffer溶解后，取1ml加入10ml已清洗微球中，室温磁力搅拌混匀10min；
(3)活化后清洗：将步骤(2)活化后胶乳22000rpm离心15min，去上清，加入37ml100mm/lph7.5的pbs缓冲液复溶备用；
(4)抗体偶联：取hytest公司货号为dd41和dd02的d二聚体鼠单克隆抗体各2ml(均为5mg/ml)，加入到上述用pbs缓冲液复溶的已活化胶乳溶液中，室温磁力搅拌3小时，完成抗体偶联；
(5)r2改造：
1)将完成抗体偶联的胶乳平均分成5份，每组8ml(命名为a4/b4/c4/d4/e4组)，多余的废弃。
2)a4组为对照组，b4/c4/d4/e4组尿素终浓度20mm/l，a组加入安慰剂335ul纯化水，b4/c4/d4/e4组分别加入500mm/l的尿素水溶液335ul，即b4/c4/d4/e4组对应尿素终浓度为20mm/l；
3)a4，b4，c4，d4，4e组分均22000rpm15min离心，a4组去全部上清，b4/c4/d4/e4组去4ml上清，即“换液50％”；
4)将x序列为ee、eee、eeee、eeeee的氨基酸支架(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)各1mg溶解于25ml支架溶解液中，可以计算得到每组实验中，抗体的质量约为(5*2+5*2)*8/40＝4mg；
b4/c4/d4/e4组各加入对应的2ml溶解有支架的溶液，b4组为ee支架，c4组为eee支架，d4组为eeee支架，e4组为eeeee支架，复溶，可以计算得抗体比支架比为1mg对应0.020mg氨基酸支架；
5)b4/c4/d4/e4组分别加入50mm/l浓度过硫酸钾溶液1.6ml，即过硫酸钾mol量为步骤4.2中尿素量的约50％；
6)b4/c4/d4/e4组37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；
(6)封闭及清洗：
a4组加入封闭清洗液10ml复溶，将b4/c4/d4/e4组22000rpm离心15min后去全部上清，加入封闭清洗液10ml复溶，室温混匀2小时备用，即为成品r2。
(7)上机测试
仪器：日立7180，上机参数，样本量4ul，180ul前述配制的r1-mab，60ulr2，700nm单波长，两点终点法，20-34读点计算δabs；
使用柏荣诊断d-dimer校准品(s10.500mg/l，s22.000mg/l，s38.000mg/l，s416.000mg/l)，零点使用生理盐水，将s2使用生理盐水稀释至1.000mg/l，将s1使用生理盐水稀释至0.100mg/l，0.250mg/l，连同s1，s2，用于最低检测限测试；
测试方案：使用a4/b4/c4/d4/e4组分别配套上述预先准备的相同r1-mab，相同参数，相同校准品定标，比较各校准点δabs，同时分别测定0.100mg/l，0.250mg/l，0.500mg/l，1.000mg/l，2.000mg/l，分别计算均值，stdev，使用stdev/均值得到精密度cv；注意，测试时从高浓度开始，精度太差，则不测更低浓度。
各实验组定标数据如下：
结果可以看出，相比对照a4组，增加支架的四组灵敏度均显著提高，支架中x代表的酸性氨基酸数量从2增加到4，灵敏度逐渐提高，3和4差别较小，均相对对照a4组灵敏度提升约145％左右；当氨基酸数量增加到5个时，灵敏度相比3个和4个氨基酸出现较大幅度降低；说明氨基酸支架x中酸性氨基酸数量较优的为3和4个。
以下为实施例4最低检测限数据：
从数据可以看出，对照a4组，lod介于0.500-1.000mg/l之间，估计在0.550mg/l左右；b4组，lod介于0.250-0.500mg/l之间，估计约为0.375mg/l左右；c4组，lod介于0.100-0.250之间，约为0.240mg/l；d4组，lod也介于0.100-0.250之间，但各浓度cv略优于c4组，lod约为0.195mg/l；e4组，lod介于0.250-0.500mg/l之间，估计约为0.41mg/l；c4和d4组，分别相对对照组lod下降到43.6％和35.4％。
上述结果表明，氨基酸支架中x的酸性氨基酸数量较优的为3-4个。
本发明通过在抗体两条重链间增加氨基酸支架来改造试剂r2，改造的试剂r2与常规试剂r1(上述r1-pab或r1-mab)配合使用，提高胶乳免疫比浊的灵敏度。
本发明主要针对常规双链单特异性抗体原料，为使用这些原料的胶乳比浊试剂通用技术。本发明不适用于单链抗体，不适用于物理吸附法至敏胶乳，不适用于未偶联的抗体，原因可能是二硫键断裂将导致未偶联抗体散架无法原位复原。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。