专利名称:预防和治疗阿尔兹海默症的g蛋白偶联受体拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防或治疗阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease)或相关的神经疾病，尤其是涉及筛选预防或治疗阿尔兹海默症的药物的方法及β-肾上腺素受体或阿片受体的拮抗剂在治疗阿尔兹海默症中的应用。
背景技术：
阿尔兹海默症的特点为渐进性的痴呆和性格变化，是最常见的与衰老相关的神经退行性病变。阿尔兹海默症影响5-11％的65岁以上年龄人群，30％的85岁以上年龄人群。阿尔兹海默症是由退化的神经元和活性的星型胶质细胞附近的淀粉样蛋白斑异常积累引起的。
淀粉样蛋白斑主要由淀粉样蛋白β(Aβ)组成。它是阿尔兹海默症的神经病理学标志，其形成被认为是阿尔兹海默症的主要病因。此外，最近的研究揭示了可弥散的寡聚化的Aβ也可以是具有神经毒性而且和阿尔兹海默症相关(Nature 416，535-9，2002)。
Aβ由Aβ前体蛋白(APP)依次通过β-和γ-分泌酶的顺序剪切形成的。如图1所示，β-分泌酶剪切Aβ前体蛋白后产生可溶的APPs-β片断和C99片断，后者随后被γ-分泌酶剪切后产生Aβ和C60片断。
Aβ至少有两种形式，即40个氨基酸形式的Aβ40和42个氨基酸形式的Aβ42。42个氨基酸形式的Aβ42更容易形成淀粉样蛋白斑，被认为和阿尔兹海默症的病因更相关。γ-分泌酶因为决定两种主要Aβ形式(Aβ40和Aβ42)的比例而在阿尔兹海默症中起着关键作用。
如图2所示，γ-分泌酶复合物包括至少四种必需组分早老蛋白-1(PS1)，nicastrin(NCSTN)，APH-1，和PEN-2。其中一般认定的催化组分早老蛋白-1的突变是引起大多数家族型阿尔兹海默症的原因，由此推断γ-分泌酶在阿尔兹海默症的病理发生中起重要作用(至少在家族型阿尔兹海默症的病理发生中)。
尽管早老蛋白-1的突变和家族型阿尔兹海默症之间的关联为阿尔兹海默症的遗传病因提供了线索，家族型阿尔兹海默症仅仅占所有阿尔兹海默症病例的不足10％。相比之下，大多数阿尔兹海默症是散发型的，说明早老蛋白-1的突变以外的因素在阿尔兹海默症的病理发生中更重要。因此，研究各种因素或环境作用如何对阿尔兹海默症的病理发生起作用是非常重要的。
以前的研究已经显示了体外细胞培养产生的Aβ能够通过激活胞内信号通路或膜受体如毒蕈碱型乙酰胆碱受体被降低。最近的证据也显示了Aβ水平和淀粉样蛋白斑的形成受生长抑素(somatostatin)或环境因素影响。
APP的剪切也能够被神经递质和突触活性调控。例如，激活与磷脂酰肌醇水解或激活蛋白激酶C相关的神经递质受体能够提高APP的代谢并降低Aβ产生(Ulus andWurtman，J.Pharm.Exp.Ther.，281，149(1997))。另一方面，激活与cAMP的产生相关的神经递质受体能够抑制星型胶质细胞瘤细胞和原代星型胶质细胞中的组成型的和蛋白激酶C/磷脂酰肌醇激活的分泌型APP的产生(Lee et al.，J.Neurochem.，68，1830(1997))。cAMP对分泌型APP的产生的作用可能是星型胶质细胞特异的，因为cAMP和蛋白激酶A激活分泌型APP的产生是在嗜铬细胞瘤PC-12细胞和人胚胎肾细胞中报导的(Xu et al.，PNASUSA，93，4081(1996)；Marambaud et al.，J.Neurochem.，67，2616(1996))。任何情况下，以上结果提示了阿尔兹海默症中由于神经元退化和神经元突触丢失而引起的神经递质水平或第二信使信号转递的改变能够破坏APP的剪切并且导致产生淀粉样的或具有神经毒性的APP片断的积累。
进一步，调控β-肾上腺素受体，引起cAMP升高的同时能够增加星型胶质细胞中APP的合成。基于此发现，美国专利6,187,756和6,043,224报道了利用β-肾上腺素受体拮抗剂调控cAMP水平来缓解APP异常表达导致的神经性病变的方法。此方法中，β-肾上腺素受体拮抗剂被用来通过调控cAMP水平抑制APP合成。
除了抑制APP合成，调控APP代谢也可以被用来缓解APP相关的淀粉样蛋白斑形成引起的神经性病变。例如，美国专利5,385,915报道了利用调控蛋白质磷酸化的试剂(即影响激酶或磷酸酶的试剂)改变APP剪切的方法和组合方式。对APP剪切的调控进而导致对淀粉样蛋白斑中积累的Aβ的产生的调控。类似的，在美国专利5,242,932报道了利用chloroquine和primaquine等化合物调控和影响哺乳动物细胞内蛋白质(包括APP)细胞内转运和剪切的方法。
虽然上述报道看来对调控APP的产生和代谢以及对淀粉样蛋白斑形成是有效的，但是还是有必要发展更多的治疗和预防阿尔兹海默症的方法和试剂。
发明内容本发明的目的是提供用于筛选治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变试剂的方法，进而提供一种试剂在治疗阿尔兹海默症中的应用。
在本发明的第一方面，提供筛选治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变试剂的方法，并提供两种技术方案。技术方案1包括以下步骤(a)激活受体并确定其初始内吞程度，所述受体为与早老蛋白-1结合的G蛋白偶联受体；(b)在一种候选试剂存在下，如(a)所述激活受体，再次确定受体的内吞程度；(c)确定(a)和(b)中的内吞程度的差异；(d)如果差异小于阈值则重复步骤(a)至(c)；或如果差异大于阈值，则确认所述候选试剂为治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变的试剂。技术方案2包括以下步骤(a)测量受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶的初始结合程度，所述受体为与早老蛋白-1结合的G蛋白偶联受体；(b)在一种候选试剂存在下，如(a)所述再次测量受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶的结合程度；(c)确定(a)和(b)中的结合程度的差异；(d)如果差异小于一定阈值则重复步骤(a)至(c)，或如果差异大于阈值，则确认所述候选试剂为治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变的试剂。
在本发明的一个优选例中，所述受体中至少一种选自β肾上腺素受体和δ-阿片受体。
在本发明的另一个优选例中，所述β肾上腺素受体可以为β2肾上腺素受体(β2AR)。
在本发明的另一个优选例中，所述受体被表达于已经转染了编码此受体基因的细胞上。
在本发明的另一个优选例中，通过检测内吞小泡的数量、内吞小泡中的早老蛋白-1、晚内吞小泡和溶酶体(LEL)中γ-分泌酶的活性或淀粉样蛋白β(Aβ)的形成而确定所述的初始内吞程度和再次内吞程度。
在本发明的另一个优选例中，通过检测荧光共振能量转移而确定所述的初始结合程度和再次结合程度。
在本发明的第二方面，提供在内吞过程中抑制与早老蛋白-1结合的G蛋白偶联受体的内吞的受体拮抗剂，用于制备治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变药物。
在本发明的第三方面，提供一种干扰G蛋白偶联受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶的结合的试剂，用于制备治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变药物。
在本发明的一个优选例中，提供β-肾上腺素受体或阿片受体的拮抗剂，用于制备治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变药物。
在本发明的另一个优选例中，提供β2肾上腺素受体(β2AR)拮抗剂，用于制备治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变药物。
在本发明的另一个优选例中，提供的拮抗剂为ICI 118，551、普萘洛尔(propranolol)、布他沙明(butoxamine)或纳曲吲哚(naltrindole)中的至少一种，用于制备治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变药物。
在本发明的另一个优选例中，提供的拮抗剂为ICI 118，551或butoxamine，用于制备治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变药物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了β-分泌酶和γ-分泌酶顺序作用于APP而产生Aβ的过程。APP首先被β-分泌酶剪切产生可溶的APPs-β和C99。C99然后被γ-分泌酶剪切产生Aβ和C60。
图2显示了γ-分泌酶的四个主要组分早老蛋白(Presenilin)，nicastrin(NCSTN)，APH-1和PEN-2。
图3显示了受体激活后内吞过程和内吞小泡向晚内吞小体和溶酶体(late endosomesand lysosomes，LEL)转运的过程。
图4显示了本发明涉及的一种筛选治疗或预防阿尔兹海默症的受体拮抗剂的方法的流程图。
图5显示了刺激G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor，GPCR)增加细胞系和原代培养海马细胞中Aβ的产生。(a-d)用ELISA方法测定细胞培养基中分泌型的Aβ(Aβ40和Aβ42)的水平。图中显示的是由至少三个独立实验得出的平均数±均数的标准误差与基本值之比(*P＜0.01)。(a)显示了Iso对共表达了β2肾上腺素受体和APPswe的HEK293细胞的分泌Aβ水平的作用。(b，c)Iso(b)或DADLE(c)对共表达了C99和β2肾上腺素受体(b)或δ-阿片受体(c)的HEK293细胞的分泌Aβ水平的作用。(d)Iso或DADLE对表达了C99的原代培养海马细胞的分泌Aβ水平的作用。(e)脉冲跟踪实验分析刺激δ-阿片受体对C99剪切的作用。Pro，propranolol；DADLE，[D-Ala2，D-Leu5]-enkephalin；NALT，naltrindole。
图6显示了刺激β2肾上腺素受体增强γ-分泌酶活性。(a)表达底物方法检测不同时间的Iso处理对HEK293细胞中的C99剪切和C60产生作用。(b-d)荧光底物方法检测Iso对C6胶质细胞(b)，大鼠海马切片(c)和β2肾上腺素受体转染的野生型小鼠和早老蛋白-1-2双缺失小鼠的胚胎成纤维细胞(d)中的γ-分泌酶活性的作用。
图7显示了δ-阿片受体激活导致的γ-分泌酶活性增强，和增强的时程。SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞(a)和海马切片(b)显示用DADLE或NALT处理30分钟后分离的细胞膜组分通过荧光底物方法检测γ-分泌酶活性。(c)显示了β2肾上腺素受体激活增强γ-分泌酶活性的时程。C6胶质细胞用Iso按所示时间处理。细胞膜组分用荧光底物方法检测γ-分泌酶活性。
图8显示了受体内吞和γ-分泌酶活性增强的相关性。(a-e)用荧光底物方法检测γ-分泌酶活性。(a)表达了β2肾上腺素受体和β2肾上腺素受体T68F，Y132G，Y219A突变体的HEK293细胞在Iso处理后的γ-分泌酶活性。(b)C6胶质细胞用霍乱毒素，forskolin或dybutylcAMP处理后的γ-分泌酶活性。(c)把C6胶质细胞用刀豆蛋白A，蔗糖溶液或去钾溶液预处理后，因Iso处理而增强的γ-分泌酶活性消失。(d)表达Dyn K44A消除了C6胶质细胞中增强的γ-分泌酶活性。(e)用clathrin RNAi抑制HEK293细胞中的clathrin表达消除了增强的γ-分泌酶活性。胞质组分用clathrin和actin的抗体检测蛋白表达。(f，g)β2肾上腺素受体L339，340A突变体(β2ARLL)和β3肾上腺素受体在Iso处理后不能内吞(f)或增强γ-分泌酶活性(g)。CTX，霍乱毒素；Fsk，forskolin；db-cAMP，dybutyl cyclic adenosinemonophosphate；PTX，百日咳毒素；Dyn K44A，dynamin II K44A；Con A，刀豆蛋白A；Suc，蔗糖溶液；K+dpl，去钾溶液；NS RNAi，非特异性RNA干扰；β2ARm，β2AR；Iso，异丙肾上腺素(isoproterenol)。
图9显示了δ-阿片受体激活导致的γ-分泌酶活性增强不能够被百日咳毒素(PTX)消除。SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞用200ng/ml百日咳毒素预处理12小时后再用1μMDADLE刺激1小时。细胞膜组分用荧光底物方法检测。
图10显示了HEK293细胞用transferrin如所标记的时间处理后，细胞膜组分用荧光底物方法检测γ-分泌酶活性。
图11显示了内吞小体内的γ-分泌酶活性和Aβ增加。(a，b)共转染了β2肾上腺素受体和图中所标记的质粒的HEK293细胞用Iso处理后，用于荧光底物方法(a)，或Aβ特异的免疫沉淀和western blot实验(b)。胞质组分用GFP抗体检测。(c)免疫分离晚内吞小体和溶酶体实验显示了Iso处理增加了共转染β2肾上腺素受体，C99和Flag-Rab7的HEK293细胞中的Aβ产生。(d)免疫荧光实验分析PS1(红)和GFP-Rab7(绿)在Iso处理后30分钟的共定位。箭头所指为包含PS1和GFP-Rab7的准确结构。
图12显示了DALDE激活δ-阿片受体后晚内吞小体和溶酶体内的γ-分泌酶活性增加。
图13显示了富集γ-分泌酶需要内吞转运。(a，b)免疫荧光实验分析PS1在转染的HEK293细胞中的定位。(a)对转染了β2肾上腺素受体和所标记的质粒Dyn K44A或Rab5S34N的HEK293细胞中PS1-NTF(红)和Flag-Rab7(绿)的共定位的分析。(b)检测DADLE处理3分钟后的PS1-NTF(红)，HA-DOR(绿)和β-adaptin(蓝)的共定位。箭头所指为包含PS1-NTF，HA-DOR和β-adaptin的准确结构。(c)Flag-β2肾上腺素受体和Flag-δ-阿片受体能够和内源的γ-分泌酶的组分相互作用。(d)转染了B2PB2 brandykinin受体的HEK293细胞在用bradykinin处理后用荧光底物方法分析γ-分泌酶活性。Con，对照；Dyn K44A，dynamin II K44A突变体；IB，immuno-blot免疫印记法.BK，bradykinin。
图14显示了γ-分泌酶活性，Aβ产生和淀粉样蛋白斑形成在活体实验中被增强，而β2肾上腺素受体选择性拮抗剂ICI 118，551有效的抑制了淀粉样蛋白斑的形成。(a，b)大鼠用去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)或clenbuterol(Cle)急性处理后，海马的γ-分泌酶活性(a)和分泌型Aβ40和Aβ42水平(b)被增强(*P＜0.01)。(c～-g)APPswe/PS1ΔE9转基因小鼠的大脑内淀粉样蛋白斑在用Iso(c)，clenbuterol(d)或ICI 118，551(f)慢性处理后被增强。图c，d和f为雌性(左)和雄性(右)小鼠的代表性的淀粉样蛋白斑。图e为图c和d的小鼠淀粉样蛋白斑的统计分析。图g为图f的小鼠淀粉样蛋白斑的统计分析。
图15显示了动物模型的实验结果。(a)可见平台实验的结果。没有发现基因型或物对本实验的作用(F＝2.145，P＝0.096)。(b)不可见平台实验的结果。发现对照组小鼠和野生型组小鼠表现出明显的差别(F＝28.754，P＜0.001)。而且，propranolol处理组小鼠与对照组小鼠相比表现出认知障碍被部分缓解(F＝4.571，P＝0.034)。nadolol(纳多洛尔)处理组小鼠与对照组小鼠相比没有差异(F＝1.192，P＝0.277)。(c)测验实验中小鼠处于平台象限中的时间百分比。发现对照组小鼠和野生型小鼠表现出明显的差异(P＝0.002)。propranolol处理部分缓解认知障碍(P＝0.048)。nadolol处理无效果(P＝0.969)。
图16显示了受体亚型选择性拮抗剂在动物模型中的实验结果。Betaxolol为能够通过血脑屏障的β1肾上腺素受体选择性的拮抗剂。ICI 118，551为能够通过血脑屏障的β2肾上腺素受体选择性的拮抗剂。(a)在可见平台实验中，没有发现药物作用(F＝0.0310，P＝0.969)。(b)在不可见平台实验中，ICI 118，551处理明显的缓解了认知障碍(F＝24.164，P＜0.001)。Betaxolol处理则表现了部分缓解作用，但是效果不显著(F＝3.698，P＝0.057)。(c)在测验实验中，ICI 118，551的作用非常显著(P＝0.005)。Betaxolol处理则无效果(P＝0.552)。
图17显示了受体亚型选择性拮抗剂在动物模型中的实验结果。Metoprolol为能够通过血脑屏障的β1肾上腺素受体选择性的拮抗剂。(a)在可见平台实验中，没有发现药物作用(F＝2.017，P＝0.139)。(b)在不可见平台实验中，Butoxamine处理明显的缓解了认知障碍(F＝15.581，P＜0.001)。Metoprolol则无效果(F＝0.104，P＝0.748)。(c)在测验实验中，Butoxamine的作用显著(P＝0.020)。Metoprolol处理则无效果(P＝0.768)。
图18显示了非转基因小鼠的结果。β肾上腺素受体的拮抗剂对非转基因小鼠无作用，表明转基因是必需的。(a)可见平台实验中无药物作用(F＝2.327，P＝0.077)。(b)不可见平台实验中无药物作用(F＝0.264，P＝0.851)。(c)测验实验中无药物作用(P＝0.817)。
图19显示了δ-阿片受体选择性的拮抗剂naltrindole的动物实验结果。Naltrindole为能够通过血脑屏障的δ-阿片受体选择性的拮抗剂。(a)在可见平台实验中，没有发现药物作用(F＝0.754，P＝0.391)。(b)在不可见平台实验中，Naltrindole处理明显的缓解了认知障碍(F＝4.945，P＜0.030)。(c)在测验实验中，Naltrindole的作用显著(P＝0.006)。Metoprolol处理则无效果(P＝0.768)。
图20显示了对照组(control)、clenbuterol处理和ICI 118，551处理的双转基因小鼠和非转基因小鼠在Morris水迷宫实验的可见平台实验中的逃逸时间。各组小鼠之间没有发现明显的药物或转基因作用(F＝2.714，P＝0.052)。
图21显示了对照组(control)、clenbuterol处理和ICI 118，551处理的双转基因小鼠和非转基因小鼠(NTg)在Morris水迷宫实验的不可见平台实验的逃逸时间。非转基因小鼠和对照组小鼠之间存在明显的转基因作用(F＝7.625，P＝0.010)。ICI 118，551处理组的小鼠比对照组小鼠表现出了更快的学习曲线(F＝16.075，P＜0.001)。然而clenbuterol处理没有作用(F＝1.713，P＝0.198)。
图22显示了最后一次不可见平台实验24小时后的测验实验中小鼠在平台象限停留时间百分比。相比之下，非转基因小鼠(P＝0.026)和ICI 118，551(P＝0.041)处理组小鼠在平台象限中停留了更长的时间。
图23显示了细胞表面DOR和PS1的相互作用。图23A共转染了供体(donor)GFP-DOR和受体(acceptor)HA-PS1(Cy3荧光素)的HEK293细胞中，用561nm激光进行荧光漂白前(红线)和后(蓝线)的混合发射谱(激发波长488nm)。发射谱显示的是同一个细胞中的经过荧光漂白(左)和没有漂白(右)的两个区域。只有在经过荧光漂白的区域里供体GFP的发射光才会增加。图23BHEK293细胞中受体荧光漂白前后非混合的GFP-DOR和PS1-Cy3图像。荧光漂白区域用白色线框显示。底部放大的伪彩显示了细胞表面在荧光漂白前后GFP发射光的强度。细胞表面的供体GFP-DOR发射光在受体PS1-Cy3荧光漂白后增强。标尺为10μm。图23C显示了细胞表面GFP-DOR和PS1-Cy3平均能量转移效率。数字为实验中的细胞数。数据为三次独立试验所得。
具体实施方式本发明涉及用于筛选预防或治疗阿尔兹海默症或其他相关神经性病变的药物的方法。
本发明还涉及肾上腺素受体或阿片受体的拮抗剂在治疗阿尔兹海默症中的应用，特别是β-肾上腺素受体和δ-阿片受体的拮抗剂。具体为，关于β-肾上腺素受体的拮抗剂在阿尔兹海默症治疗中的新用途，和δ-阿片受体的拮抗剂在阿尔兹海默症治疗中的新用途。本发明也涉及用于筛选可能被用来治疗阿尔兹海默症或其他相关神经性病变的试剂的方法。
如前所述，家族型阿尔兹海默症仅占所有阿尔兹海默症的10％。所以，遗传因素以外的因素可能在阿尔兹海默症的病因中起重要作用。环境因素，如应激，可能通过激活受体施加作用，包括G蛋白偶联受体中的β-肾上腺素受体和δ-阿片受体。中枢神经系统表达几种G蛋白偶联受体，尤其是β2-肾上腺素受体，表达在海马和皮层，即阿尔兹海默症病理发生过程中主要涉及的区域。在中枢神经系统中，这些受体作用于肾上腺素、多巴胺和阿片肽的信号转导，引起多种神经功能的调控，如刺激响应、学习、记忆和痛觉。
一旦被激活，这些受体偶联鸟嘌呤结合蛋白(G蛋白)异源三聚体并且通过调控细胞内第二信使水平(如cAMP)诱导下游信号。此外，激活的受体也会发生clathrin介导的内吞，这种内吞不仅在受体脱敏中也在信号转导中起关键作用。内吞后的G蛋白偶联受体通过早内吞小泡、晚内吞小泡和溶酶体(LEL)循环。不同内吞小泡的转运受Rab GTPase介导，其本身也可以作为各种小泡的标记。
本发明基于发明者的创新发现，即激活β-肾上腺素受体(尤其是β2-肾上腺素受体)或δ-阿片受体导致γ-分泌酶在晚期内吞小体和溶酶体中的积累增加。γ-分泌酶作为一种天冬氨酸蛋白酶，酸性pH的反应环境是其最佳条件。因此γ-分泌酶在酸性的晚期内吞小体和溶酶体中的积累增加，导致其活性增强，并且使得Aβ的产生也增加。
图3显示了从激活β-肾上腺素受体或δ-阿片受体至增加Aβ产生的途径。如图3所示，激活β-肾上腺素受体和δ-阿片受体伴随着clathrin介导的内吞，包括形成clathrin包被的凹陷(clathrin-coated pits，CCP)以及CCP的脱离。本发明的发明人发现γ-分泌酶的活性组分，早老蛋白-1(PS1)组成型的结合这些受体。此内吞的结果为，早老蛋白-1或γ-分泌酶被带入内吞小泡。接着，通过Rab5和Rab7介导的小泡运输，这些内吞小泡被转化为晚内吞小体和溶酶体(LEL)，于是γ-分泌酶活性在这里被增强。增强的γ-分泌酶活性之后引起Aβ产生的增加。
这些发现提示了用拮抗剂抑制β-肾上腺素受体和δ-阿片受体能够防止γ-分泌酶的活性增加。相应的，这些受体的拮抗剂可以用来降低Aβ产生，因此可以用来预防或治疗阿尔兹海默症或相关神经性病变。本发明中，“拮抗剂”包括防止、降低或抑制受体激活的化合物。这类化合物可以和受体激活剂竞争相同的受体结合位点，或结合受体上的不同位点并降低受体激活剂的作用。
此外，这些发现提示可以通过检测相关受体的内吞来筛选潜在的可用于预防或治疗阿尔兹海默症或相关的神经性病变的拮抗剂。测定这些受体的内吞可以通过检测早老蛋白-1或γ-分泌酶的内吞，晚内吞小体和溶酶体内早老蛋白-1或γ-分泌酶的积累，γ-分泌酶的活性增强，或Aβ产生增加来实现。
相应的，本发明具体的涉及关于筛选治疗或预防阿尔兹海默症或相关的神经性病变的试剂的方法。筛选方法可能是基于候选试剂抑制与早老蛋白-1或γ-分泌酶结合的受体的内吞的能力，或者基于其减弱或消除受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶结合的能力。如图4所示，本发明的方法(方法40)包括测量候选试剂存在或不存在的情况下与早老蛋白-1或γ-分泌酶结合的受体的内吞的程度，或者检测受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶结合的程度(步骤41)。这些受体包括内源或载体转染导入的G蛋白偶联受体。
然后，确定存在或不存在候选试剂情况下的内吞或结合程度的差异(步骤42)。如上所述，内吞程度可以用计量内吞小泡、内吞的早老蛋白-1或γ-分泌酶、LEL中早老蛋白-1或γ-分泌酶的增加、LEL中γ-分泌酶活性的增强或Aβ产量的增加来实现。受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶结合的程度可用任意适当的方法测定，例如下面将详细描述的荧光共振能量转移实验(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。
如果内吞或结合的差异(经步骤42测定)是显著的或者超过了某个阈值，则候选试剂可能被用来治疗或预防阿尔兹海默症或相关的神经性病变(如步骤43所示)。如果差异不显著，则可以用另一候选试剂重复前一步骤(如步骤44所示)。注意图4所示的方法是顺序显示的，每次试验一个候选试剂，本领域技术人员会愿意同时试验多种试剂，例如通过使用多孔板或其它高通量方法。本领域技术人员可以通过所熟知的统计学方法获得该阈值，即如果细胞中G蛋白偶联受体与早老蛋白1的再次内吞程度在统计学上低于初始内吞程度(优选显著低于，比如G蛋白偶联受体与早老蛋白1的再次内吞程度是初始内吞程度的60％或更低)，就表明差异显著。所述初始内吞程度指使用候选试剂前激活受体并确定的内吞程度，再次内吞程度是指于同一试验体系中使用候选试剂后激活受体并确定的内吞程度。
本发明具体的涉及通过给人体服用有效量的结合β-肾上腺素受体(尤其是β2-肾上腺素受体)和/或δ-阿片受体的拮抗剂用以治疗或防治阿尔兹海默症或其他相关神经性病变的方法。有效剂量的拮抗剂足以减少导致γ-分泌酶向晚期内吞小体和溶酶体转运的受体内吞。本发明还涉及将结合β-肾上腺素受体(尤其是β2-肾上腺素受体)和δ-阿片受体的拮抗剂应用于生产治疗或防治阿尔兹海默症和其他神经性病变的药物。
结合β-肾上腺素受体和/或δ-阿片受体的拮抗剂的有效剂量将依赖于向病人输送药物的服药方式，服药频率，和药剂组分，以及病人的体重，性别，年龄和身体状况。典型的，有效剂量的范围可以为从每天1μg/Kg体重至10mg/Kg体重。虽然存在个体差异，本领域技术人员有能力确定每种成分的最佳有效剂量。向病人给药可以通过任何合适的类似药剂的给药途径，包括口服，注射，透皮贴剂等。
本发明涉及的化合物或组分可以用于治疗哺乳动物(人或其他哺乳动物)的阿尔兹海默症或其他相关神经性病变。这些化合物或组分包括药剂学上可以接受的载体和/或赋形剂，例如生理盐水，缓冲液，葡萄糖，甘油、乙醇，淀粉等。此外，这些化合物或组分可以制备成类似药剂常用的剂量剂型，包括针剂，片剂，胶囊，贴剂等。这些剂量剂型的制备方法为已知技术。
尽管有不同降低Aβ产生的方法已被报导，包括调控APP的产生(如美国专利6,187,756和6,043,224)和抑制APP的剪切(如美国专利5,242,932)，但本发明的内容是基于一种不同的机制，即抑制导致γ-分泌酶向晚期内吞小体和溶酶体转运的受体内吞。以下的实验和实施例清楚地阐述了将β-肾上腺素受体(尤其是β2-肾上腺素受体)和/或δ-阿片受体的拮抗剂或抑制剂用于治疗或防治阿尔兹海默症的基本原理。
实施例1激活β2-肾上腺素受体增加Aβ产生首先在HEK293细胞中检验激活β2-肾上腺素受体对Aβ产生的作用。HEK293细胞具有有功能的G蛋白偶联受体的信号通路，并且能正常分泌Aβ。本实验中使用的HEK293细胞转染了β2-肾上腺素受体和APP的突变体(APPswe)。突变体APPswe是家族型阿尔兹海默症的“Swedish”突变，即在第670和671个密码子的突变。如图5a所示，用激动剂isoproterenol(Iso)激活β2-肾上腺素受体，增加了两种Aβ亚型(Aβ40和Aβ42)的分泌水平。另一方面，加入了β2-肾上腺素受体的拮抗剂propranolo1(Pro)则消除了Iso对Aβ分泌水平的增加作用，而其本身并无作用。Aβ产生的增加需要γ-分泌酶，因为用γ-分泌酶的特异性抑制剂L685，458预处理消除了Aβ产生的增加。
将HEK293细胞共转染了γ-分泌酶的底物(C99)和β2-肾上腺素受体的实验进一步证实了γ-分泌酶参与了β2-肾上腺素受体引起的Aβ产生的增加。C99是β-分泌酶介导的APP剪切的产物(见图1)。C99是γ-分泌酶的直接底物和Aβ的直接前体。图5b显示了在共转染的HEK293细胞中用Iso刺激β2-肾上腺素受体导致了Aβ产生的增加，并且和此前描述的共转染了APPswe和β2-肾上腺素受体的细胞相当。同样的，这个增加也能被Pro消除，而其本身并无作用。因此，分泌的Aβ产生增加是由于γ-分泌酶的活性增加导致的。
除了β2-肾上腺素受体，激活δ-阿片受体也能够导致分泌的Aβ水平的增加。如图5c所示，DADLE(D-Ala2-D-Leu5-enkephalin，δ-阿片受体的激动剂)处理转染了C99的HEK293细胞导致Aβ产生的增加。使用δ-阿片受体的拮抗剂NALT(naltrindole)则消除了DADLE的作用。尽管以上实验使用的是经过转染受体的细胞，但在内源受体上也得到了同样的结果。图5d显示了在转染了C99的原代海马细胞中，激活内源的β-肾上腺素受体或δ-阿片受体同样引起Aβ的分泌增加。
以上实验清楚地证明了激活β-肾上腺素受体或δ-阿片受体会引起Aβ的分泌增加。脉冲追踪实验显示了分泌的Aβ是由转染的C99剪切产生的。如图5e所示，C99的代谢速度在DADLE刺激的共转染了δ-阿片受体和C99的HEK293细胞中比对照细胞更快。此结果提示了受体的激活促进了C99的剪切。因此，激活β-肾上腺素受体(尤其是β2-肾上腺素受体)和/或δ-阿片受体加强了Aβ的产生和分泌，是由于γ-分泌酶对C99(或类似底物)的剪切增强导致的。
实施例2激活β2-肾上腺素受体增加γ-分泌酶的活性以上所述的激活β-肾上腺素受体或δ-阿片受体引起的Aβ的产生增加可能是因γ-分泌酶的表达水平或活性增加而导致的。为了回答这个问题，发明人检验了β2-肾上腺素受体激活对γ-分泌酶的表达水平和活性的作用。如图6a所示，在Iso处理的转染了C99的HEK293细胞中，C60的产生增加了。C60是C99被γ-分泌酶介导的剪切产生的。但是，相同的处理没有对PS1的表达水平产生任何改变。PS1是γ-分泌酶的活性位点亚基，以氨基和碳基末段片段的异源二聚体形式存在(即PS1-NTF和PS1-CTF)。此结果提示了激活β2-肾上腺素受体后，γ-分泌酶的活性增加而γ-分泌酶的表达没有改变。
为直接测量γ-分泌酶的酶活性，使用了荧光底物。此荧光底物基于连接了荧光报告分子的γ-分泌酶特异的底物序列。C6胶质细胞瘤的内源β-肾上腺素受体被刺激30分钟后γ-分泌酶的活性增强(图6b)。此效果在海马切片中被验证(图6c)。小鼠胚胎纤维组织母细胞缺失了presenilin后Iso引起的γ-分泌酶活性增强被消除，验证了此方法对γ-分泌酶活性的特异性(图6d)。综上所述，这些结果显示了激活β2-肾上腺素受体刺激了γ-分泌酶活性，导致Aβ的产生增加。
激活受体而增强γ-分泌酶活性并不仅限于β-肾上腺素受体。刺激SH-SY5Y神经母细胞瘤(图7a)或培养的原代海马细胞(图7b)的内源δ-阿片受体也能够获得类似结果。进一步，检测γ-分泌酶的活性显示了γ-分泌酶的活性在刺激β2-肾上腺素受体30分钟左右达到最大值，约60分钟时恢复到本底水平(图7c)。
实施例3增强的γ-分泌酶活性不依赖于cAMP信号如上所述，G蛋白偶联受体(包括β2-肾上腺素受体)一旦被激活，会诱导Gs蛋白依赖的腺苷酸环化酶的激活，导致细胞内cAMP水平升高。为了描述β2-肾上腺素受体激活导致γ-分泌酶活性增强的分子机制，在后续实验中使用了一个无法激活Gs蛋白的β2-肾上腺素受体的突变体(β2AR T68F，Y132G，Y219A，或β2AR TYY)。这个突变体无法消除γ-分泌酶活性的增强(图8a)。这个结果排除了Gs蛋白信号通路参与β2-肾上腺素受体对于γ-分泌酶的作用。进一步，用诸如霍乱毒素(cholera toxin，CTX)，forskolin，和dybutyl-cAMP等能够模拟Gs蛋白激活和cAMP水平升高的试剂处理细胞，无法导致γ-分泌酶活性的增强(图8b)。因此，激活β-肾上腺素受体而增强的γ-分泌酶活性并没有cAMP信号通路的参与。
事实上cAMP信号通路并没有参与增强γ-分泌酶的活性可能对于δ-阿片受体也成立。已知δ-阿片受体激活百日咳毒素(PTX)敏感的Gi/o蛋白并且通过抑制腺苷酸环化酶降低cAMP水平。用百日咳毒素对SH-SY5Y神经母细胞瘤预处理不能改变DADLE刺激引起的γ-分泌酶活性增强(图9)。此结果显示了激活δ-阿片受体引起的γ-分泌酶活性不由cAMP调控。因此，β2-肾上腺素受体或δ-阿片受体对γ-分泌酶的调控不依赖于G蛋白信号通路或经典的cAMP通路。
实施例4受体内吞与γ-分泌酶的活性增强相关如果G蛋白信号通路或cAMP通路不参与增强γ-分泌酶的活性，那么其机制是什么？如前针对图3的讨论，GPCR(包括β-肾上腺素受体和阿片受体)激活通常伴随着受体内吞，及其引起特异性的信号通路。受体内吞及其相关的信号转导是否参与了γ-分泌酶活性的提高可以用不同的内吞通路抑制剂来检测。
图8c显示了Iso对γ-分泌酶活性的作用可以被内吞抑制剂如刀豆蛋白(Con A)，高渗透压溶液(Suc)和无钾溶液(K+dpl)的预处理消除。图8d显示了Iso引起的γ-分泌酶活性增强可以被dynamin的显性负突变体Dyn K44A(能够抑制clathrin或caveolin介导的内吞)消除。因为β2-肾上腺素受体主要通过clathrin介导的机制内吞，所以针对clathrin重链的小干扰RNA(small interfering RNA)可以被用来去除细胞内的clathrin表达。图8e显示了Iso引起的γ-分泌酶活性增强可以被RNA干扰(RNA interference，RNAi)消除。这些结果显示了β2-肾上腺素受体引起的γ-分泌酶活性增强是通过激动剂诱导的clathrin介导的内吞作用调控的。
为了进一步确证激动剂引起的β2-肾上腺素受体内吞对于γ-分泌酶活性增强是必需的，在实验中使用了另一个β2-肾上腺素受体的突变体(β2AR L339/340A，β2AR LL)和另一个内在的肾上腺素受体β3-肾上腺素受体，这两个受体都不具有激动剂引起的内吞现象。在HEK293细胞内激活这些受体确实提高cAMP水平，但是既不能引起受体内吞(图8f)也不能增强γ-分泌酶活性(图8g)。这些结果清楚的提示了激动剂引起的clathrin介导的β2-肾上腺素受体内吞参与了调控γ-分泌酶活性增强的机制。
上述实验说明clathrin介导的内吞是激活受体而引起的γ-分泌酶活性增强的必要条件。但是，clathrin介导的内吞其本身是否足以引起γ-分泌酶活性增强仍不清楚。为了回答这个问题，用transferrin处理HEK293细胞，导致transferrin受体的clathrin介导的持续内吞。如图10所示，transferrin处理虽然能引起持续内吞，但不能增强γ-分泌酶的活性。这些结果提示了clathrin介导的内吞对于β2-肾上腺素受体引起的γ-分泌酶的活性增强是必需的但不是充分的。
实施例5γ-分泌酶的活性和Aβ产生增强和内吞途径联系如图3所示，一旦进入细胞内，内吞小泡就被通过各种特异性的内吞途径转运至其目的地。这些内吞途径涉及Rab鸟苷三磷酸酶(Rab GTPase)调控的胞内囊泡转运。现已知从细胞膜向早内吞小体和继续向晚内吞小体和溶酶体的内吞运输能够分别被早内吞小体标记Rab5和溶酶体标记Rab7的显性负突变体Rab5 S34N和Rab7 T22N抑制。如图11a和b所示，在HEK293细胞中表达Rab5 S34N或Rab7 T22N能够消除激活β2-肾上腺素受体引起的γ-分泌酶的活性(图11a)和Aβ产生(图11b)的增强。这些结果说明γ-分泌酶的活性和Aβ产生的增强必需有内吞小泡向晚内吞小体和溶酶体的转运，因此晚内吞小体和溶酶体的参与对β2-肾上腺素受体引起的γ-分泌酶活性和Aβ产生起着关键作用中。
为了进一步显示晚内吞小体和溶酶体的作用，利用Flag抗体从转染了Flag-Rab7的细胞中免疫分离晚内吞小体和溶酶体的小泡，随后用早内吞小体的标记EEA1(earlyendosome antigen 1)和晚内吞小体和溶酶体的标记LAMP-1(lysosome-associated membraneprotein-1)确证了组分。如图11c所示，在β2-肾上腺素受体经1小时刺激后发现晚内吞小体和溶酶体中的Aβ含量明显增加，而Flag-Rab7或LAMP-1无显著变化，显示了晚内吞小体和溶酶体中的Aβ产生因β2-肾上腺素受体激活而增加，且无需增加晚内吞小体和溶酶体的数量。
同样，晚内吞小体和溶酶体参与增强γ-分泌酶活性也不仅限于β-肾上腺素受体。图12显示了晚内吞小体和溶酶体中的γ-分泌酶活性也在δ-阿片受体激活后增强了。图12的实验是用1μM DADLE对SH-SY5Y神经母细胞瘤刺激30分钟后进行亚细胞组分分离，再将各组分用于碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)和荧光底物分析。结果显示DADLE处理只增强了含有碱性磷酸酶细胞组分的γ-分泌酶活性(*P＜0.01)。
综上所述，以上图11和图12所示结果提示了晚内吞小体和溶酶体在β2-肾上腺素受体或δ-阿片受体激活对Aβ产生的作用中起非常重要的角色。这个发现和以前的关于内吞囊泡为γ-分泌酶活性提供适宜环境的报导相一致。
为了进一步确证晚内吞小体和溶酶体中的γ-分泌酶和Aβ产生增加相关，应用免疫荧光显微术检测刺激β2-肾上腺素受体是否增加了γ-分泌酶在晚内吞小体和溶酶体中的定位。在细胞实验中，晚内吞小体和溶酶体用表达的GFP-Rab7标记。图11d展示在转染的HEK293细胞中，激活β2-肾上腺素受体30分钟后，发生了PS1(γ-分泌酶活性位点亚基)和GFP-Rab7的共定位。在海马切片的实验中，晚内吞小体和溶酶体用LAMP-1的抗体标记。图11e展示了Iso处理后PS1或nicatrin(另一γ-分泌酶组分)和LAMP-1的共定位增强。综上所述，以上结果提示了刺激β2-肾上腺素受体增强了γ-分泌酶在晚内吞小体和溶酶体中定位，此作用导致了γ-分泌酶活性和Aβ产生的增加。
实施例6组成型PS1/γ-分泌酶和β2-肾上腺素受体的相互作用
Dyn K44A和Rab5 S34N有效的防止了β2-肾上腺素受体刺激后PS1在晚内吞小体和溶酶体中定位增强(图13a)，此结果提示PS1可能是被从细胞膜向晚内吞小体和溶酶体转运。利用β-adaptin(其能够标记clathrin包被的凹陷和小泡)发现刺激HEK293细胞中的δ-阿片受体3分钟后PS1和β-adaptin以及内吞的受体形成共定位(图13b)。这些发现提示了PS1和激活的β2-肾上腺素受体或δ-阿片受体在激动剂刺激后形成共内吞。而此结果并不意外，因为PS1能够组成型的结合膜蛋白，例如APP和Notch，而且β2-肾上腺素受体能够通过形成异源二聚体介导其他跨膜蛋白的内吞。为了证明确实如此，应用免疫共沉淀方法检测了PS1和β2-肾上腺素受体或δ-阿片受体的结合。
如图13c所示，四个γ-分泌酶的必须组分PS1，nicastrin，APH-1a(anterior pharynxdefective-1a)和PEN-2(presenilin enhancer-2)在含有CHAPSO的缓冲液中被β2-肾上腺素受体或δ-阿片受体共沉淀(图13c)，在此缓冲液中γ-分泌酶保持为蛋白复合物。用TrintonX-100替换CHAPSO能够解聚γ-分泌酶蛋白复合物，并且破坏了受体与nicastrin，APH-1a和PEN-2的共沉淀，而不影响经PS1-NTF或PS1-CTF抗体检测到的受体与PS1的共沉淀(图13c)。这些结果提示了β2-肾上腺素受体或δ-阿片受体通过直接结合PS1与γ-分泌酶相互作用。但是，并非所有G蛋白偶联受体(GPCR)都有这种结合，因为另一GPCR成员，B2 bradykinin受体(B2R)，无法结合PS1/γ-分泌酶(图13c)或引起γ-分泌酶的活性增强(图13d)。综上所述，这些结果提示β2-肾上腺素受体或δ-阿片受体与PS1的相互作用是特异性的，并且提供了它们调控受体激活引起的γ-分泌酶活性增强的机制基础。此外，这些结果也提示能够减弱或消除受体与早老蛋白1结合的试剂是潜在的治疗或预防阿尔兹海默症或其他相关的神经性病变的药物。
实施例7筛选能够减弱或消除受体与早老蛋白1结合的试剂通过任何合适的方法，如荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，可以筛选能够消除或减弱早老蛋白1与受体结合的试剂。荧光共振能量转移是能量从近距离结合(≤10nm)的供体荧光素向受体荧光素转移的过程。因此，这项技术可被用来检测物理上结合在一起的蛋白质。在能量转移中，非放射性的能量转移减弱了供体的荧光发射。因此通过比较供体在同一样品被破坏受体荧光素(如荧光漂白的方法)前后的荧光发射的强度来检测能量转移。如果发生能量转移，则供体的荧光发射在荧光漂白受体后增强。
例如在共转染的HEK293细胞中检测有绿色荧光蛋白(GFP)标记的δ-阿片受体(GFP-DOR)和早老蛋白1-Cy3之间的能量转移效率在荧光漂白前后的变化。细胞共转染了GFP标记的δ-阿片受体(GFP-DOR)和有HA标记的早老蛋白1(HA-PS1)。HA-PS1的表达可以通过HA的第一抗体和连接Cy3荧光素的第二抗体(Jackson ImmunoResearch公司)检测，GFP-DOR的表达通过GFP荧光素检测。
图23A-23C显示了此类实验的结果之一。用Leica共聚焦显微镜获取图像，包括供体GFP-DOR和受体PS1-Cy3荧光素的混合发射谱(488nm激光激发)。首先检测在共表达两个蛋白质的HEK293细胞中供体(GFP-DOR)发射光的强度在受体(PS1-Cy3)荧光漂白后是否增强。图23A显示了细胞在荧光漂白前后的荧光漂白和非荧光漂白区域的图像。选定的区域用Cy3吸收谱内的561nm激光漂白。GFP-DOR发射光相应的强度在荧光漂白的区域与相同细胞的非漂白区域相比有较大增强。此结果显示了GFP和Cy3之间发生了能量转移，且此能量转移能够通过荧光漂白Cy3被消除或降低。
图23B显示了转染的HEK293细胞中GFP-DOR和PS1-Cy3在受体经561nm激光荧光漂白前后代表性的图像。GFP-DOR的图像显示了受体的荧光发射(伪彩强度图像)在荧光漂白后增强，且此增强只在细胞内荧光漂白的区域发生。
如图23C所示，细胞表面附近的GFP-DOR和PS1-Cy3的平均相对能量转移效率大约为22.8±3.9％，显示了两者的相互作用。在阳性对照中，表达了GFP-DOR的细胞用GFP第一抗体以及连接了Cy3的第二抗体孵育。此阳性对照的能量转移效率为27.9±5.3％。将表达了GFP-DOR的细胞用针对非特异性蛋白actin的第一抗体以及连接了Cy3的第二抗体孵育作为阴性对照。此阴性对照的能量转移效率为7.8±4.7％。这些结果都显示了δ-阿片受体和早老蛋白1之间的相互作用。
实施例8动物体内γ-分泌酶活性的增强，Aβ产生和淀粉样蛋白斑的形成进一步在动物体内对β2-肾上腺素受体与这些阿尔兹海默症相关分子的作用进行研究。大鼠体内实验显示急性注射了肾上腺素受体内源配体去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)或β2-肾上腺素受体选择性的激动剂clenbutera1(Cle)后，大鼠海马的γ-分泌酶活性(图14a)和Aβ水平(图14b)都显著升高了。基于这些结果，可以预料对动物模型长期给予这些受体激动剂处理可能加剧阿尔兹海默症的病理变化。在阿尔兹海默症的小鼠模型(APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠)中的实验证实了这一点。这种小鼠在给予Iso或Cle慢性处理30天后显示出了增多的大脑淀粉样蛋白斑(图14c-14e)。这个发现说明激活β2-肾上腺素受体能够增进γ-分泌酶活性，Aβ产生和淀粉样蛋白斑形成。所以，这些受体的拮抗剂应可以被用来降低Aβ产生或淀粉样蛋白斑形成。图14f和14g中的结果验证了这一点，因为β2-肾上腺素受体特异性的拮抗剂ICI 118，551显著的降低了淀粉样蛋白斑的数量。
实施例9动物模型体内实验为了衡量β-肾上腺素受体的拮抗剂的体内有效性，对阿尔兹海默症的转基因模型小鼠(APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠)给予了这些化合物。在大约6个月龄时，这种小鼠已产生进行性的空间记忆缺陷，并且伴随着大脑内Aβ水平升高和淀粉样蛋白斑增多。
在以下实验中，APPswe/PS1ΔE9小鼠和非转基因(NTg)的同窝小鼠被按照性别和年龄匹配的方式分组。实验化合物通过口服给药，从4个月的年龄开始并持续1个或2个月。利用Morris水迷宫的实验评价各种化合物对APPswe/PS1ΔE9小鼠和非转基因小鼠的作用。
Morris水迷宫实验由神经科学家Richard G.Morris于1984研制，现今为常用的研究海马在空间记忆形成中作用的方法。实验中的迷宫为一注入了24-25℃水的圆形水池(直径1.2米)，并加入奶粉使水不透明。水池周围放置固定的空间指示，包括印有醒目图案的帘布和置有明显物体的架子。实验期间，小鼠被小心的面对池壁至于水中。小鼠首先接受一定数量的可见平台训练(即连续两天，每天八次)，学习游至一有杆标记的升高的圆形平台(直径10厘米)上。可见平台训练被分为每天两组(即每组四次训练)以进行统计学数据分析。可见平台训练期间，每次训练的平台位置(东北，东南，西南或西北)和起始位置(东、南、西或北)为伪随机决定。
不可见平台训练也进行一定天数(即连续6天，每天四次)，其间小鼠被允许寻找置于水面以下1.5厘米处的平台。小鼠如无法在60秒内找到平台则被指引到平台。不可见平台实验期间，平台的位置保持不变，小鼠则按照从四个方向(东、南、西或北)中伪随机选择的一个方向进入水池。每一次训练结束后，小鼠在平台上停留30秒后再被从平台上转移到笼内。
最后一次不可见平台训练的二十四小时后，进行一次测验实验。这时平台被移走，小鼠则允许游泳60秒钟试图寻找平台。所有实验被固定于水池正上方的的摄像机检测并记录，记录用计算机跟踪系统进行分析。
动物模型试验1在这一组实验中，APPswe/PS1ΔE9转基因小鼠和非转基因小鼠被给予propranolol和nadolol以评价β-肾上腺素受体的拮抗剂对淀粉样蛋白斑形成的作用。APPswe/PS1ΔE9转基因小鼠和非转基因小鼠被按照性别和年龄匹配的方式分组。化合物通过口服给药，从4个月年龄开始持续直至6个月。Propranolol能够容易的通过血脑屏障，因此，它能够拮抗中枢神经系统的β-肾上腺素受体。另一方面，nadolol也是一种β-肾上腺素受体的拮抗剂，但是不能通过血脑屏障。小鼠然后用Morris水迷宫实验进行空间学习和记忆检测。
在Morris水迷宫任务中，小鼠首先进行两天的可见平台训练，每天进行两组训练。在每组训练中，记录小鼠找到并且爬上平台所耗费的时间(逃逸时间)。此训练中没有显示基因型或药物作用(F＝2.145，P＝0.096，图15a)。
接着，小鼠进行了六天不可见平台训练，每天进行一组训练。对照组小鼠相比非转基因组小鼠表现出明显的障碍(F＝28.754，P＜0.001，图15b)。propanolol处理与对照组相比能够部分缓解小鼠的障碍(F＝4.571，P＝0.034)，但是nadolol处理则表现为无效(F＝1.192，P＝0.277)。
最后，小鼠在最后一次不可见平台训练后24小时进行一次测验实验。在此实验中，小鼠被允许自由游泳1分钟以寻找平台。对小鼠耗费在平台象限的时间比例进行分析(图15c)。同样，转基因小鼠和非转基因小鼠表现出显著的基因型作用(P＝0.002)。Propranolol处理部分地缓解了转基因小鼠的空间记忆障碍(P＝0.048)，而nadolol则表现为无效(P＝0.969)。Propranolol在平台实验中显示的效果并非是由游泳速度差异造成的(图15d)。
以上研究清楚地显示了propranolol能够拮抗中枢神经系统的β-肾上腺素受体。因为propranolol是一种非选择性的β-肾上腺素受体拮抗剂，所以进一步利用亚型选择性的β-肾上腺素受体拮抗剂研究体内哪一种亚型能够引起上述效果。使用的亚型选择性的β-肾上腺素受体拮抗剂包括Betaxolol(倍他洛尔)和ICI 118，511。Betaxolol是一种能够通过血脑屏障的β1-肾上腺素受体。ICI 118，511是一种能够通过血脑屏障的β2-肾上腺素受体。
在可见平台训练中，没有显示出药物作用(图16a，F＝0.0310，P＝0.969)。然而，在不可见平台训练中(图16b)，ICI 118，551处理显著的缓解了认知障碍(F＝24.164，P＜0.001)。Betaxolol表现出一定效果。但是，这个效果(F＝3.698，P＝0.057)和ICI 118，551相比不显著。在测验实验中(图16c)，ICI 118，551的作用很显著(P＝0.005)。同样，Betaxolol的效果(P＝0.552)和ICI 118，551相比则表现不显著。Propranolol在实验中显示的效果并非是由游泳速度差异造成的(图16d)。
另一比较亚型选择性的β-肾上腺素受体拮抗剂的实验证实了β2-肾上腺素受体拮抗剂的效果更强。图17a-17d显示了与图16相似的动物实验结果。Metoprolol(美托洛尔)是一种能够通过血脑屏障的β1-肾上腺素受体拮抗剂。Butoxamine是一种能够通过血脑屏障的β2-肾上腺素受体拮抗剂。如图17a所示，在可见平台训练中，没有显示出药物作用(F＝2.017，P＝0.139)。但是，在图17b显示的不可见平台训练中，Butoxamine处理显著的缓解了认知障碍(F＝15.581，P＜0.001)。相反，Metoprolol处理则表现为无效(F＝0.104，P＝0.748)。图17c显示了在测验实验中butoxamine的作用很显著(P＝0.020)，而metoprolol则无效(P＝0.768)。同样，实验中显示的效果并非是由游泳速度差异造成的(图17d)。
综上所述，以上结果提示β-肾上腺素受体拮抗剂主要靶向中枢神经系统的β-肾上腺素受体以实现降低γ-分泌酶活性和Aβ产生。进一步，大部分所需要的缓解空间记忆缺陷的作用可以通过抑制β2-肾上腺素受体实现，而抑制β1-肾上腺素受体没有作用。因此，根据本发明的目的，用来防治或治疗阿尔兹海默症的β-肾上腺素受体拮抗剂应更倾向于作用于β2-肾上腺素受体。
进一步实验中，这些β-肾上腺素受体拮抗剂对非转基因小鼠表现为无效。如图18所示，可见平台训练(图18a，F＝2.327，P＝0.077)，不可见平台训练(图18b，F＝0.264，P＝0.851)以及测验实验(图18c，P＝0.817)都没有表现出药物作用。这些结果提示了尽管这些β-肾上腺素受体拮抗剂在缓解记忆缺陷中有效，但是对于没有记忆缺陷的正常个体则没有明显效果。
图19a-19c显示了与图15相似的动物实验结果，但这里使用的是δ-阿片受体拮抗剂Naltrindole。Naltrindole是一种能够通过血脑屏障的δ-阿片受体拮抗剂。如图19a所示，在可见平台训练中，没有显示出药物作用(F＝0.754，P＝0.391)。在图19b显示的不可见平台训练中，Naltrindole处理显著的缓解了认知障碍(F＝4.945，P＜0.030)。图19c显示了Naltrindole在测验实验中的显著作用(P＝0.006)。
动物模型试验2在进一步的动物实验中，4月龄的APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠口服生理盐水(Sal)，2mg/kg clenbuterol(β2-肾上腺素受体激动剂)或1mg/kg ICI 118，551(β2-肾上腺素受体拮抗剂)30天后用Morris水迷宫实验(如上所述)检测空间学习和记忆。
实验中的迷宫为一注入了24-25℃水的圆形水池(直径1.2米)，并加入奶粉使水不透明。水池周围放置固定的空间指示，包括印有醒目图案的帘布和置有明显物体的架子。实验期间，小鼠被小心的面对池壁至于水中。小鼠首先接受一定数量的可见平台训练(即连续两天，每天八次)，学习游至一有杆标记的升高的圆形平台(直径10厘米)上。可见平台训练被分为每天两组(即每组四次训练)以进行统计学数据分析。可见平台训练期间，每次训练的平台位置(东北，东南，西南或西北)和起始位置(东、南、西或北)为伪随机决定。
图20显示了对照组、clenbuterol(克伦特罗)处理和ICI 118，551处理的双转基因小鼠和非转基因小鼠在Morris水迷宫实验的可见平台实验的逃逸时间。各组小鼠之间没有发现明显的药物或转基因作用(F＝2.714，P＝0.052)。
不可见平台训练连续进行6天(每天4次训练)，小鼠寻找水面以下1.5cm处的一平台。如果在60秒内无法找到平台，小鼠则被引领到平台处。在不可见平台训练中，平台的位置保持不变，小鼠则从四个方向(东、南、西或北)中伪随机选择的一个方向进入水池。在每次不可见平台训练后，小鼠在平台上停留30秒后再被从平台上转移到笼内。
图21显示了对照组、clenbuterol处理和ICI 118，551处理的双转基因小鼠和非转基因小鼠在Morris水迷宫实验的不可见平台实验的逃逸时间。非转基因小鼠和对照组小鼠之间存在明显的转基因作用(F＝7.625，P＝0.010)。ICI 118，551处理组的小鼠比对照组小鼠表现出了更快的学习曲线(F＝16.075，P＜0.001)。然而clenbuterol处理没有作用(F＝1.713，P＝0.198)。这些结果提示ICI 118，551可以有效的缓解转基因小鼠的空间记忆障碍。
最后一次不可见平台训练的二十四小时后，进行一次测验实验。这时平台被移走，小鼠则允许游泳60秒钟试图寻找平台。所有实验被固定于水池正上方的的摄像机检测并记录，记录用计算机跟踪系统进行分析。
图22显示了最后一次不可见平台实验24小时后的测验实验中小鼠在平台象限停留时间百分比。相比之下，非转基因小鼠(P＝0.026)和ICI 118，551(P＝0.041)处理组小鼠在平台象限中停留了更长的时间。
实验方法和试剂下面对上述的实验和实施例中一些特殊的步骤进行描述。对本技术领域：
的一般技术人员来说熟知的一般性生物化学和分子生物学技术，在此不再赘述。
质粒和试剂所有试剂除非特别标明都是购自于Sigma。人全长APP克隆入pcDNA3载体，通过PCR突变为APPswe。带有APP信号肽的C99克隆入pcDNA3载体。DNA序列的准确性通过测序确定。人clathrin重链的RNAi质粒按以下序列设计5’-GCTGGGAAAACTCTTCAGATT-3’。对照(NS)RNAi质粒为5’-GGCCGCAAAGACCTTGTCCTTA-3’。
动物和药物处理所有动物实验都严格遵照美国国立卫生研究院有关实验动物的护理与使用的规定。急性处理实验中，Sprague-Dawly(SD)大鼠(购自上海实验动物中心)被侧脑室注射2微克去甲肾上腺素。坐标为前-后(anterior-posterior)，
左-右(left-right)，
背-腹(dorsal-ventral)，
大鼠腹腔急性注射0.5mg/kg clenbuterol。30天慢性处理实验中，5个月龄的APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠(购自The Jackson Laboratory)安装插管(前-后，～0.9mm；左-右，～1.5mm；背-腹，～3.8mm)后每天注射生理盐水(n＝4，2个雌性和2个雄性)或3nM Iso(n＝6，4个雌性和2个雄性)。APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠每天给予口服生理盐水(n＝6，3个雌性和3个雄性)，2mg/kg clenbuterol(n＝7，4个雌性和3个雄性)，和1mg/kg ICI 118，551(n＝6，3个雌性和3个雄性)。
免疫组织化学和计数淀粉样蛋白斑小鼠麻醉后通过心脏生理盐水灌流。分离大脑，半脑用4％多聚甲醛在4℃固定5小时。半脑冠状切片成10微米。切片经Aβ抗体6E10孵育，再用TRITC连接的二抗孵育。切片然后用激光共聚焦显微镜(Leica公司TCS SP2)观察。淀粉样蛋白斑的面积用Image-Pro Plus 5.1软件(Media Cybernetic公司)统计。
海马培养和急性切片制备原代海马培养从新生SD大鼠制备，用Amaxa Nucleofector系统电转，培养于B27/neurobasal培养基(Invitrogen公司)两周后用于激动剂处理实验。急性海马切片用8周龄的SD大鼠制备。
酶联免疫吸附检测(ELISA)淀粉样蛋白β细胞用Iso或DADLE处理1小时后继续培养6小时。培养基用于酶联免疫吸附试剂盒(Biosource公司)检测Aβ40和Aβ42。大鼠海马匀浆后于100,000×g离心1小时。上清用于酶联免疫吸附试剂盒(Wako公司)检测Aβ40和Aβ42。
免疫沉淀
HEK293细胞或大鼠海马切片于RIPA缓冲液中裂解。Flag标记的受体和内源δ-阿片受体用Flag抗体连接的琼脂糖珠或δ-阿片受体抗体(Santa Cruz生物技术公司)免疫沉淀。免疫沉淀复合物用SDS-PAGE分离后用免疫印记法检测。
表达底物方法实验步骤如Journal of Biological Chemistry 276，481-7(2001)所述。HEK293细胞裂解后，分成含总蛋白50微克蛋白的等份于13,000×g离心15分钟。细胞膜组分重悬后于50微升含有蛋白酶抑制剂1，10-菲咯啉(phenanthroline)，抑肽酶(aprotinin)和亮肽素(leupeptin)的反应缓冲液中与37℃孵育反应2小时。反应完成后以免疫印记法检测膜组分中产生的C60。
荧光底物方法实验方法如Journal of Biological Chemistry 278，24277-84(2003)所述。细胞或海马组织裂解或匀浆。含有50微克蛋白的等份于13,000×g离心15分钟。细胞膜组分重悬后于50微升含有12微摩尔荧光底物(Calbiochem公司)的反应缓冲液中37℃孵育反应2小时。之后，用分光光度计测量激发波长为355nm和发射波长为440nm的荧光强度。
脉冲跟踪实验共转染了HA-C99和DOR的HEK293细胞用不含有甲硫氨酸和血清的培养基(Invitrogen公司)饥饿2小时后，用500μCi[35S]甲硫氨酸(GE Healthcare公司)在有或无DADLE刺激的情况下脉冲标记1小时。随后细胞在含有过量甲硫氨酸的培养基中跟踪3小时。细胞裂解液中的C99用HA抗体免疫沉淀，再用放射自显影分析。
免疫分离晚内吞小体和溶酶体本实验方法依照Journal of Biological Chemistry 278，11386-92(2003)所述小泡分离方法改进。共转染了β2AR，C99和Flag-Rab7的HEK293细胞匀浆后于500×g离心10分钟。获得的上清与M2抗体连接的琼脂糖珠于4℃孵育8小时。分离的晚内吞小体和溶酶体用LAMP-1和EEA1抗体(BD Biosciences公司)以western blot方法检测。
免疫荧光显微镜术转染了HA标记的受体和/或GFP-Rab7或GFP-Rab7 T22N的HEK293细胞中，首先用HA抗体孵育30分钟，然后用激动剂处理并固定。转染了Flag-Rab7和HA-Dyn K44A或GFP-Rab5 S34N的细胞实验中，细胞用激动剂处理并固定。急性海马切片实验中，切片首先用Iso或DADLE处理然后固定并切片。后续染色用第一抗体(包括PS1-NTF，Flag，LAMP-1或β-adaptin抗体或FITC连接的HA抗体)和第二抗体(Cy3连接的抗兔和FITC连接的抗鼠抗体，均购自Jackson ImmunoResearch公司)。用激光共聚焦显微镜(Leica TCSSP2)获取图像。早老蛋白-1N端(PS1-NTF)抗体购自Calbiochem公司。
荧光共振能量转移实验测量受体与早老蛋白1之间的相互作用用于荧光共振能量转移实验的图像由Leica TCS SP2共聚焦显微镜获取并用相应软件分析。HEK293细胞共转染了GFP-DOR和HA-PS1。HA-PS1表达用HA的第一抗体和连接了Cy3荧光素的第二抗体检测，GFP-DOR表达用GFP荧光检测。细胞的GFP-DOR或PS1-Cy3的荧光谱用488nm激光在λ模式获取。为了测量能量转移效率，用Leica软件实现受体荧光漂白。选定的细胞表面区域用561nm激光荧光漂白Cy3荧光素。共转染了GFP-PS1和HA-PS1的HEK293细胞中Cy3信号在荧光漂白后平均下降84±5.3％(n＝50)。能量转移表示为GFP-DOR(供体)信号在PS1-Cy3(受体)荧光漂白后的增加。相对能量效率按计算为(1-[Cy3 I漂白前/Cy3 I漂白后])×100％。细胞表面没有荧光漂白的区域进行能量转移分析以作为对照。
数据分析细胞实验的数据用t-test比较平均值。小鼠数据用方差分析和t-test分析显著性差异。
以上结合有限数量的具体实施例阐述了本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求
书所限定的范围。
权利要求
1.一种筛选治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变的试剂的方法，其特征在于包括以下步骤(a)激活受体并确定其初始内吞程度，所述受体为与早老蛋白-1结合的G蛋白偶联受体；(b)在一种候选试剂存在下，如(a)所述激活受体，再次确定受体的内吞程度；(c)确定(a)和(b)中的内吞程度的差异；(d)如果差异小于阈值则重复步骤(a)至(c)，或如果差异大于阈值，则确认所述候选试剂为治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变的试剂。
2.一种筛选治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变的试剂的方法，其特征在于包括以下步骤(a)测量受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶的初始结合程度，所述受体为与早老蛋白-1结合的G蛋白偶联受体；(b)在一种候选试剂存在下，如(a)所述再次测量受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶的结合程度；(c)确定(a)和(b)中的结合程度的差异；(d)如果差异小于一定阈值则重复步骤(a)至(c)，或如果差异大于阈值，则确认所述候选试剂为治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变的试剂。
3.如权利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述受体中至少一种选自β肾上腺素受体和δ-阿片受体。
4.如权利要求
3所述的方法，其特征在于，所述β肾上腺素受体为β2肾上腺素受体。
5.如权利要求
1至4所述的任一种的方法，其特征在于，所述受体被表达于已经转染了编码此受体基因的细胞上。
6.如权利要求
1、3、4或5所述的任一种的方法，其特征在于通过检测内吞小泡的数量、内吞小泡中的早老蛋白-1、晚内吞小泡和溶酶体中γ-分泌酶的活性或淀粉样蛋白β的形成而确定所述的初始内吞程度和再次内吞程度。
7.如权利要求
2至5所述的任一种的方法，其特征在于通过检测荧光共振能量转移而确定所述的初始结合程度和再次结合程度。
8.受体拮抗剂在制备治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变药物中的应用，其特征在于，在内吞过程中，所述受体拮抗剂抑制与早老蛋白-1结合的G蛋白偶联受体的内吞。
9.一种试剂在制备治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变药物中的应用，其特征在于，所述试剂干扰G蛋白偶联受体与早老蛋白-1或γ-分泌酶的结合。
10.如权利要求
8或9所述的应用，其特征在于，其中所述受体中至少一种选自β肾上腺素受体和δ-阿片受体。
11.如权利要求
10所述的应用，其特征在于，其中所述β肾上腺素受体为β2肾上腺素受体。
12.如权利要求
8、10或11所述的任一种的应用，其特征在于，所述拮抗剂中至少一种选自ICI 118，551、普萘洛尔、布他沙明或纳曲吲哚。
13.如权利要求
8、10或11所述的任一种的应用，其特征在于，所述拮抗剂为ICI118，551或布他沙明。
专利摘要
本发明提供了用于筛选治疗或预防阿尔兹海默症或相关神经性病变试剂的方法。本发明的方法包括以下步骤(a)激活受体并确定其内吞程度，此受体为G蛋白偶联受体并且和早老蛋白－1结合；(b)在一种候选试剂存在下如(a)所述激活受体，再次确定受体的内吞程度；(c)确定(a)和(b)中的内吞程度的差异；(d)如果差异小于一定阈值则重复步骤(a)－(c)。本发明还提供了利用受体的拮抗剂制造治疗或预防阿尔兹海默症或相关的神经性病变的药物。这种受体拮抗剂能够抑制和早老蛋白－1结合的G蛋白偶联受体的内吞。
文档编号C12Q1/00GK1991364SQ200610162480
公开日2007年7月4日 申请日期2006年11月17日
发明者裴钢, 倪燕翔, 赵晓辉 申请人:中国科学院上海生命科学研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan