例如，离子选择或过滤与随后的裂解结合起来可以消除干扰物质，在复杂样品例如生物样 品中尤其有用。
[0061] 在另一实施例中，采用混合质谱仪系统可以确定质荷比，所述系统包括静电离 子陷阱质量分析仪，其具有高分辨率和准确的质量确定，例如Q-Exactive?质谱仪系统 (ThermoFisherScientific)，其含有四极质量分析仪和Orbitrap?质量分析仪。此处，离 子经四极质量分析仪选择，之后进入设陷阱装置，在其中，给定的离子群被收集，碰撞冷却， 并以高能量和精确的轨道喷射进入Orbitrap质量分析仪。或者，前体离子经四极质量分析 仪选择，进入碰撞室，由此产生产物离子，之后生产物离子通过设陷阱装置，在其中，给定离 子群被收集，冷却碰撞，并以高能量和精确的轨道喷射进入Orbitrap质量分析仪。离子以 与（z/m)1/2成比例的频率轴向振荡通过阱（trap)，其中z是离子的电荷，m是离子的质量。这 些振荡离子的影像电流被检测，并采用傅里叶变换将其频域数据变换为质谱信息。瞬态收 集时间越长，接下来的质谱数据的分辨率越高。可以获得高分辨率数据，其值超过200000， 质量准确性达到5ppm(parts-per_million)或更好。
[0062] 例如，来自色谱柱的液体溶剂流（streamorflow)可能含有一种或多种感兴趣的 分析物，其进入LC-MS/MS分析仪的加热雾化器界面，溶剂/分析物混合物变换为蒸汽。随 着分析物进入气相，源自感兴趣的分析物的离子可以在液相中形成，之后通过ESI源的雾 化或中性分析物和反应离子之间的反应，其被喷射进入气相。
[0063] 离子通过仪器的开口，并且在进入仪器之前通过一系列的透镜、四极、六极和类似 装置。在一个实施例中，可以分析任何m/z比值的选定m/z窗口（例如3,5，10,20,30,40， 50,100,1800或更多道尔顿范围的m/z)，以确定窗口内完整蛋白质的分子量。总体上，较小 的m/z窗口尺寸能够提高信噪比。除了上述的m/z窗口大小，根据实验条件，可以在任何地 方动态调整m/z窗口大小。在另一实施例中，来自窗口的预先确定的离子进入碰撞室，与中 性气体分子（例如氩气、氮气等）碰撞并裂解。产生的片段离子进入质量分析仪，其中裂解 的离子被分离，并前进至检测器。在其它实施例中，其它裂解过程可以包括但不限于：经红 外多光子解离（IRMPD)的红外光子吸收，单一紫外线（UV)光子的吸收，经包括电子转移解 离（ETD)的离子-离子反应，或不经历即刻裂解的电子转移产物离子的碰撞激活，电子捕获 解离（ECD)。在示范的实施例中，解离方法是高能碰撞诱导的解离（HCD)。当离子与检测器 碰撞时，它们产生模拟信号，其进一步变换为数字信号。
[0064] 所获得的数据被中继给计算机，其对电压和时间作图。所得到的质量色谱图类似 于传统HPLC法产生的色谱图。可以通过计算色谱图的尖峰下的面积（如果有色谱尖峰的 话）或者采用质谱的尖峰强度，来确定感兴趣分析物的浓度。通过现有技术中多种不同技 术中的一种确定样品中感兴趣分析物（例如蛋白质）的浓度，包括外校正或内校正、相对定 量、尖峰高或面积计数、标准添加、或其它任何本领域的已知方法。
[0065] A?微生物鉴定
[0066] I.微生物破碎和蛋白质溶解
[0067] 再次参见图1A，如步骤102中所示，怀疑含有一种或多种微生物的样品可以被破 碎并处理以直接从样品（例如尿）获得微生物细胞，或可以用于分离纯的培养物。之后采 用微生物细胞以产生蛋白质的可溶部分。该样品可以是怀疑含有一种或多种微生物的任何 类型，包括但不限于：来自培养板的分离菌落；液体生长基质上的细胞；血、唾液、尿、粪便、 痰、伤口和体表拭子；食品和饮料；土壤、水、空气；环境和工业表面拭子。
[0068] 可以通过本领域公知的机械、化学、酶方法进行细胞破碎，上文参照图2对其进行 了详细的描述。破碎之后，可以通过离心、过滤（人工或自动进行）或其它本领域已知的方 法将样品的不溶部分（典型地，细胞壁材料、特定脂类、沉淀蛋白质和其它细胞组分）从溶 液中除去。可以采用一个或多个计算机（见图2中的202和215)控制的机器人系统自动 进行样品制备。所述机器人系统可以是更大系统的一部分，并且与其它装置或计算机相连。
[0069] 在一个例子中，采用1毫米的菌环从合适的培养板，例如OXOID?的胰酶大豆琼脂 板（ThermoFisherScientific)表面收集其上活跃生长的大肠杆菌细胞。细胞悬浮于70% 乙醇溶液中，其中采用的水是LC/MS级，处理几分钟之后，离心样品，并弃去上清液。然后采 用含有2. 5%三氟醋酸的乙腈：水（1 :1)对细胞进行裂解，样品以14000转/分钟离心5分 钟左右后，除去不溶组分。离心后，上清液被移至新管，可以采用离心浓缩机或在氮气流下 按常规完全蒸发。分析前，样品复溶于2%乙腈、含有0.2%甲酸（当采用色谱时）的98% 水中，或者复溶于含有2%甲酸的乙腈：水（1:1)中，用于流动注射或直接输入。复溶的样 品经高分辨率质谱分析法进行直接分析，或者经高分辨率质谱分析法进行快速部分色谱分 呙和分析。
[0070] 在另一例子中，采用2毫米菌环从合适的培养板，例如0X0ID?的胰酶大豆琼脂板 (ThermoFisherScientific)表面收集约10毫克（湿重）其上活跃生长的细胞（大肠杆 菌，木糖葡萄球菌，玫瑰色库克菌，巨大芽胞杆菌，包皮垢分支杆菌或其它）。细胞移至0. 5 毫升微离心管内，加入20微升含有25%乙腈、25%水、50%甲酸的溶液中；将吸液体积增加 至40微升；对悬浮液剧烈地吸上吸下，直至细胞破碎，其表现为出现泡沫。然后加入180微 升乙腈：水（1 :1)，所得到的溶液以14000转/分钟离心大约5分钟。去除上清液，根据需 要进行稀释以用于直接输入或流动注射。
[0071] 在另一例子中，采用离心机从液体生长基，例如沙保罗氏液体培养基（0X0ID?， ThermoFisherScientific)中收集白念珠菌细胞。用0.9%生理盐水冲洗三次将细胞从 生长基中冲下并沉淀。之后可以用乙醇和甲基叔丁基醚（7:3)的混合物在室温下对细胞 预处理10分钟或更少。通过离心来沉淀细胞，弃去上清液。可以采用包括大约70%甲酸、 15%乙腈和15%水的混合物溶解细胞并使蛋白质溶解。不溶组分以14000转/分钟离心 5分钟沉淀，将上清液移至干净小瓶或者离心管内，在色谱分析之前用含有0. 2%甲酸的乙 腈：水（2 :98)进行稀释。当不进行色谱分析时，上清液按照以下方式稀释：调整溶剂溶度 至乙腈：水（1:1)，其中含有0.2-2%甲酸。除了乙腈，还可以采用甲醇。离心后，稀释后的 上清液可以进行在线（in-line)固相提取，可以经过或不经过快速部分色谱分离和高分辨 率质谱分析。或者，乙腈：水（1 :1)的0. 2-2%甲酸中的样品要么流动注射，要么直接输入 质谱仪进行分析。
[0072] II.样品脱盐、浓缩和色谱分离
[0073] 步骤102中微生物破碎产生的上清液含有完整蛋白质，可以对其进行进一步处理 以对蛋白质脱盐和浓缩，如附图IA的步骤104中所示。在一个实施例中，采用自动固相提 取/液相色谱样品引入界面系统以同时对完整蛋白质进行脱盐、浓缩和分离。所述系统300 的简要示意图参见图3。在第一流路302中，系统300可以采用一次性的固相提取（SPE)盒 304,该盒与泵306、流路管线308、第一开关阀310、第二开关阀312和电喷雾离子化（ESI) 喷雾器314连接。SPE盒304是可调的，例如采用2%乙腈/0.2%甲酸水溶液（上样缓冲 液）。之后，将图IA的步骤102中制备的样品从基本相同的溶液上样（loaded)，例如采用 反向流动通过SPE盒304。之后SPE盒304用2个床（bed)体积的上样缓冲液清洗，以去除 盐和其它污染物。清洗步骤之后，每个样品从SPE盒304中流出，其溶剂体积可以小至10纳 升或更少，或者多至十几微升，以对完整蛋白质进行浓缩和优化以便传递至ESI喷雾器314 和质谱仪316。
[0074] 在一个实施例中，在线SPE盒可以是聚丙稀头，例如Stage?头（ThermoFisher Scientific)，其中含有的小体积二氧化硅吸附剂包含键合的C4、C8、C18或其它固定在该头 中的功能基团。在替换实施例中，可以采用聚合物吸附剂或螯合剂。床体积可以是约1微 升至1毫升。该设备和方法非常适用于源自微生物细胞的复杂样品，这是因为，每个SPE盒 仅使用一次，将一个样品至另一个的过载问题降至最低。
[0075] III.离子化，质谱分析，氨基酸序列信息
[0076] 如图IA的步骤106所示，样品接受质谱分析。流出的蛋白质被离子化，例如被电喷 雾离子化（ESI)或其它大气压或亚大气压的离子化技术来离子化，这些技术易于与液相色 谱在线结合。对于ESI，基于游离N端、组氨酸、赖氨酸、精氨酸或序列中存在的其它带电氨 基酸的数量，蛋白质积累多个电荷。所得到的质谱反映了来自相同蛋白质、表现为不同质量 /电荷（m/z)值的多电荷离子（"电荷状态的外壳（envelope)"）的分布。m/z比值是同一 分析物从电喷雾离子过程获得不同电荷数量的结果。电荷状态的分布易于经单级或多级高 分辨率质谱分析、通过由上至下的方法检测出样品是否包含完整蛋白质和/或其片段。可 通过多种方法计算出蛋白质的分子量。其包括简单的方法，例如观察单电荷状态的相邻同 位素之间的距离，采用源自相同蛋白质的几个相邻同位素未分辨尖峰的m/z比值以确定或 计算，以及确定这些尖峰之间m/z的间隔距离。其它计算分子量的方法包括颠簸（thrash) 算法和最大摘法。
[0077] 离子化之后，蛋白质通过质量分析仪进行分析。如步骤108和110所示，以全扫描 高分辨MS模式在选择的m/z范围内对样品重复扫描。在一个实施例中，以全扫描高分辨MS 模式在m/z是150至m/z是2000的范围内，在大约1秒内对样品重复扫描，以大约5ppm、 3ppm、lppm或更好的质量准确性对完整蛋白质进行质量测量。在该实施例中，源参数设置如 下：喷雾电压=4千伏，毛细管温度=270摄氏度，源温度=60摄氏度。对于示例性的液相 色谱流速是400微升/分钟，源鞘气体的流速是35 (任何单位），辅助气体的流速是5 (任何 单位），源温度=60摄氏度。所得到的质量准确性足以提供蛋白质的元素组成信息（例如， 蛋白质中存在的碳、氮、氧、氢、硫或其它原子的数量）。该信息可以进一步用作算法的一部 分以鉴定微生物。
[0078] 本公开中，术语"质量准确性"和"ppm"是指测量得到的量与实际真值的一致程度。 在质谱分析测量离子质量或尤其是质荷比时，实验测量的质量和离子的真实质量之间的差 值或误差根据下面的等式用ppm单位表示：（（测量质量一真实质量）/真实质量）X1〇~6 =质量准确性（ppm)。
[0079] 将分子的单独同位素的质量相加得到离子的真实质量，包括对离子电荷状态的任 何校正。例如，含有两个氢1原子、一个氧16原子、电荷是+1的离子化水分子的真实质量 是：（（1. 007825+1. 007825+15. 994915) - 0? 000549) = 18. 010016 道尔顿。如果该离子的 测量质量是18. 010200道尔顿（Da)，则测量的准确性是（（18. 010200道尔顿一 18. 010016 道尔顿V(18. 010016 道尔顿）X1〇~6 = 10. 2ppm。
[0080] 由于未知蛋白质、或任何源自生物学的或源自MSn的蛋白质片段的质量测定准确 性达到5ppm或更好，所以当搜索已知蛋白质数据库时，可以缩小所发现的候选者的数量。
[0081] 图4描述了通过直接输入对大肠杆菌提取物进行的全扫描电喷雾质谱。扫描范围 是m/z是400至m/z是1800。如本申请中所述获取该提取物，不进行进一步的纯化或脱盐。 除了一些小分子、小肽和脂类之外，尖峰主要代表多电荷的中至高质量蛋白质。该扫描提供 质量控制信息，即该仪器工作正常，其信号稳定地用于进一步的详细分析。总分析时间是1 秒。
[0082] 图4中所示的50道尔顿的窗口的质量分离见图5。扫描的质量范围是m/z是750 至m/z是800。图中显示了多于9个的同位素分辨尖峰，表示9个不同蛋白质的不同电荷状 态，其m/z比值是如下：759. 4283(+18)、761. 7664(+14)、766. 8419(+12)、769. 7618(+12)、 771. 5050 (+10)、782. 8381(