一种c反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及一种C反应蛋白（CR巧近红外巧光检测试 剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] C反应蛋白（c-reactiveprotein,CRP)是由肝脏合成的一个相对分子质量为 1.15X103的五环结构，在它的每一边都有亲巧性结合位点，且其分子代谢周期的半衰期仅 为5-7小时，因此在补体系统的免疫调节中扮演了一个重要的生物学角色。CRP是公认的最 有价值的典型急性时相蛋白，正常血浆水平小于5mg/l，机体受到感染、外伤、肿瘤及理化因 素刺激后5-8小时迅速升高，24小时内峰值可为正常值的数百倍。若感染得到控制CRP可 在24-48小时内迅速下降，1周内恢复正常。CRP可与调亡细胞、坏死细胞膜磯脂或细菌、真 菌、寄生虫的细胞壁磯酸胆碱结合，激活补体，调理吞瞻功能，促使内源性或外源性配体物 质的清除。
[0003] 目前，CRP的测定广泛地应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断，特别是快速定量 CRP检测在儿科疾病的诊断中得到较好的应用。在细菌感染急性期CRP水平显著升高，而在 病毒感染时CRP水平正常或轻微升高，因此CRP水平可作为细菌感染或病毒感染首选鉴别 诊断指标；在鉴别呼吸道感染时，细菌性肺炎常导致CRP水平升高到60mg/LW上，而急性支 气管炎很少导致CRP水平的显著升高，所W测定CRP水平有助于鉴别肺炎和支气管炎，减少 对非细菌性急性支气管炎患者予抗生素治疗；外科手术后若病人继发细菌感染特别是化脈 性感染时，CRP明显升高（大于50mg/L)，手术第2天达到高峰，72小时后开始逐步下降，恢 复时间因手术部位和组织损伤程度而异，故CRP还可W作为诊断感染和手术后并发症的一 项指标；此外，研究还表明CRP还可能与风湿性疾病、系统性红斑狼疮、外科学、妇产科学、 胃肠病学、血液学和肿瘤学等密切相关，应用范围还将不断扩大。
[0004] 超敏C反应蛋白化ypersensitive-CRP，hs-CRP)与普通CRP就是同一种蛋白，只 是由于其测定方法更敏感而得名。采用临床常规方法测定CRP时，检测的线性范围一般为 3-200mg/l，因检测方法缺乏足够的敏感性，无法测出血液中含量更低的CRP。近年来相继采 用胶乳增强的免疫散射比浊法、免疫投射比浊法、免疫发光法等技术使检测的灵敏度得到 了很大提高，检测低限延伸为0. 005~0.lOmg/l，使得低浓度CRP(如0. 15~lOmg/L)的测 定更加准确。
[0005] 近年来关于CRP、hs-CRP的研究越来越多，应用越来越广泛。在感染、屯、脑血管性 疾病、糖尿病、代谢综合征、外周血管病、慢性阻塞性肺病、哮喘、肿瘤等多种疾病中用于指 导临床诊疗。目前已经知道，CRP和hs-CRP的临床意义并不完全相同。CRP在感染性疾病 和结缔组织病中有较高的应用价值，而hs-CRP近年来在屯、脑血管疾病、糖尿病中越来越受 到关注。
[0006] 人类C反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时 血浆中一些急剧上升的蛋白质（急性蛋白）。CRP可W激活补体和加强吞瞻细胞的吞瞻而 起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，调亡的组织细胞，在机体的天 然免疫过程中发挥重要的保护作用。关于CRP的研究已经有70多年的历史，传统观点认为 CRP是一种非特异的炎症标志物，但近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样 硬化等屯、血管疾病，并且是屯、血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。
[0007] 作为急性时相反应的一个极灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性屯、肌梗死、创伤、 感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。结合临床病 史，有助于随访病程。特别在炎症过程中，随访风湿病、系统性红斑狼疮、白血病等。
[000引 C反应蛋白测试可W鉴别细菌或病毒感染，监测病情，监控术后感染，抗生素疗效 观察，预测屯、血管病危险等，C反应蛋白对诊断和治疗都很有价值，因此其测定速度就有重 要意义。
【发明内容】
[0009] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种C反应蛋白近红外巧 光检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的C反应蛋白近红外巧光检测技术，解决现有 技术中的问题。
[0010] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种C反应蛋白近红外巧 光检测试剂盒及其用途。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外巧光检测技术，可快速，准 确的检测出人血清、血浆、全血中全程C反应蛋白（超敏C反应蛋白化sCR巧和常规C反应 蛋白（CRP))的浓度，供临床机构作辅助诊断用。
[0011] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种C反应蛋白近红外巧 光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫 巧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。
[0012] 优选的，所述免疫巧光探针为抗C反应蛋白单克隆抗体包被的近红外巧光乳胶微 球颗粒。
[0013] 硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体和所述近红外巧光乳胶微球颗 粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体可W为相同的抗C反应蛋白单克隆抗体，也可W为不 同的抗C反应蛋白单克隆抗体。
[0014] 更优选的，所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为Abeam? Anti-CReactiveProteinantibody[CRP13引，所述近红外巧光乳胶微球颗粒上包被的抗 C反应蛋白单克隆抗体为Abeam篡Anti-CReactiveProteinantibody[CRP-8](油13426)， 或所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为Abeam及.Anti-CReactive Proteinantibody[CRP-8](油13426)，所述近红外巧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋 白单克隆抗体为Abeam?.Anti-CReactiveProteinantibody[CRP13引。
[0015] 更优选的，所述巧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
[0016] 近红外光（NIR)，是介于可见光（VI巧和中红外光（MIR)之间的电磁波，ASTM定义 NIR为波长在780nm-2526皿范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或巧光强度很 小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大 为减少。
[0017] 本发明第二方面提供所述c反应蛋白近红外巧光检测试剂盒的制备方法，包括如 下步骤：
[0018] 1)用缓冲液将巧光乳胶微粒离屯、清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分 散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入邸CA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳 胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；
[0019] 2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备 用；
[0020] 3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
[0021] 4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫巧光探针的玻璃纤维 素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外巧光检测试剂盒。
[0022] 优选的，所述步骤1中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠離， 制备获得探针溶液，所述冠離选自二环已基-18-冠-6、15-冠離-5、18-冠離-6中的一种 或多种的组合。
[0023] 更优选的，步骤1制备获得的探针溶液中冠離的浓度为0.l-20mg/ml，更优选为 4-8mg/ml。
[0024] 优选的，所述步骤1中，缓冲液为磯酸盐（PB巧缓冲液。
[0025] 更优选的，所述PBS缓冲液为0. 009-0.Ollmol/L，PH7. 25-7. 35的PBS缓冲液。
[0026] 优选的，所述步骤1中，巧光乳胶微粒的直径为140-160nm。
[0027] 优选的，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、邸CA的重量比为 9-11 ;0. 9-1. 1 ;0. 9-1. 1。
[002引在本发明一实施例中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的投料量分别为Img、lOOug、lOOug。
[0029] 优选的，所述封闭液为己醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调 整己醇胺的用量。
[0030] 优选的，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
[003U本领域技术人员可选取适当浓度和抑的PBS缓冲液，更优选为0. 009-0.Ollmol/ L，PH7. 25-7. 35 的PBS缓冲液。
[0032] 优选的，所述步骤2中，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠離， 所述冠離选自二环已基-18-冠-6、15-冠離-5、18-冠離-6中的一种或多种的组合。
[0033] 更优选的，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠離的浓度为 0.l-20mg/ml，更优选为 4-8mg/ml。
[0034] 优选的，所述步骤2中，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白 单克隆抗体的浓度为1.8-2. 2mg/ml。
[0035] 优选的，所述步骤2中，抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为 0. 9-1.lul/cm。
[0036] 优选的，所述步骤2中，烘干的具体条件为36-38°C烘箱烘干。
[0037] 所述喷加过程利用微量蛋白点膜系统。
[0038] 优选的，所述步骤1中的抗C反应蛋白单克隆抗体为Abcam?_Anti-CReactive Proteinantibody[CRP135]，所述步骤2中的抗C反应蛋白单克隆抗体为Abeam寬Anti-C ReactiveProteinantibody[CRP-8](油13426)，或所述步骤1中的抗C反应蛋白单克隆抗 体为Abcam?.Anti-CReactiveProteinantibody[CRP-引（abl；M26)，所述步骤 2 中的抗 C反应蛋白单克隆抗体为Abcan愧Anti-CReactiveProteinantibody[CRP135]。
[0039] 优选的，所述步骤3中，干燥的具体条件为真空干燥机干燥。
[0040] 本发明第=方面提供所述C反应蛋白近红外巧光检测试剂盒在C反应蛋白检测领 域的用途。
[0041] 所述用途具体为使用所述C反应蛋白近红外巧光检测试剂盒对样品中的C反应蛋 白进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。
[0042] 本发明所提供的检测试剂盒结合近红外巧光检测技术，可快速，准确的检测出人 血清、血浆、全血中全程C反应蛋白（超敏C反应蛋白化sCR巧和常规C反应蛋白（CRP)) 的浓度。所述试剂盒采用免疫巧光层析法，其最小可测量可达〇.5pg/ml，检测方便、成本低， 灵敏度高，特异性好，比同类定量诊断试剂价格低20-30%，大大节约了社会医疗成本，检测 过程中样品收集及处理简单，可快速准确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用， 并可应用到临床检测中，为临床治疗提供定性依据。
【具体实施方式】
[0043] W下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明