还可W通过另外不同的具体实 施方式加W实施或应用，本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0044] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"该个"包括复数形式。
[0045]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0046] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。该些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULARCLONING;ALABORATORYMANUAL,Secondedition,ColdSpringHarbor L油oratoryPress，1989and"Thirdedition，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSIN MOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates；theseries METHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego；Wolffe,CHROMATINSTRUCTUREAND FUNCTION,Iliirdedition,AcademicPress,SanDiego, 1998 ;METH0DSINENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego， 1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119,Chromatin Protocols(P.B. Becker, ed. )Humana Press, Totowa，1999 等。
[0047] 本发明各实施例中试验样品由浦东新区人民医院提供。近红外巧光检测仪，由上 海凯创生物技术有限公司开发提供。
[004引实施例1
[0049] 1.免疫巧光抗C反应蛋白抗体颗粒制备；
[0化0] 用0.Olmol/L，PH7. 3 + 0. 05的磯酸盐缓冲液将直径为150皿的巧光乳胶微粒 离屯、清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入Abeam坂Anti-CReactive Proteinantibody[CRP13引；加入邸CA使抗体与颗粒偶联；加入封闭液封闭乳胶颗粒上多 余的基团，再加入二环已基-18-冠-6。按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体，100微 克的邸CA用量标记。每毫克的微球乳胶最后加相当于20微克的己醇胺当量的封闭液进行 封闭，冠離的终浓度为6mg/ml。
[0化1] 2.试剂盒的制备；
[0化引用0. 01M pH7. 2的PBS缓冲液稀释Abeam?.Anti-C Reactive Protein antibody [CRP-引（油13426)至浓度2. Omg/ml，并加入冠離，冠離的终浓度为6mg/ml，再利 用微量蛋白点膜系统将溶液喷加到适当孔径的硝酸纤维素膜上，按lul/cm的量进行喷膜， 37 °C烘箱烘干备用。
[005引用制备好的探针（步骤1制得的标记有Abeam風Anti-C Reactive Protein antibody [CRP13引的近红外巧光乳胶微球）溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备 用。
[0化4]将包被抗C反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫巧光探针的玻璃纤维素 膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外巧光检测试剂盒。
[0化5]实施例2
[0056] C反应蛋白近红外巧光检测法实验：
[0057] 试剂盒检测；
[0化引 W C反应蛋白标准品和PBS缓冲液分别配置浓度为0. 5pg/ml、0. 8pg/ml、l.化g/ ml、^g/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、 500pg/ml、1000pg/ml的C反应蛋白标准溶液，W化g/ml作为空白对照，空白对照及每个浓 度的标准品均重复测定5次。标准品及试剂盒均平衡至室温开始检测，用滴管在每个试剂 盒的加样孔内滴加3滴样本（约120-150U1)。15分钟时，用近红外巧光检测仪检测巧光信 号，并用巧光仪器进行判断，分析仪的对巧光信号的检测范围是AD值0-10000。WC反应蛋 白浓度为横坐标，近红外巧光检测仪检测巧光信号（平均值）为纵坐标，建立标准曲线。在 标准曲线上，随着标准品浓度的升高，测得的巧光信号值也随之升高。
[0化9] 根据标准曲线计算可知，本试剂盒对0. 5pg/ml、0. 8pg/ml的样品可W部分检出， 对1.化g/ml的样品全部检出，其最低检出限《1.Opg/ml，并在2-lOOOpg/ml的范围具有良 好的线性。
[0060] 各浓度的批内最大evs为4. 1%，平均evs为3.6% (每个浓度的样品同批进行测 试），各浓度的批间最大eVs为4. 8%，平均eVs为4. 2% (每个浓度的样品分5批进行测 试）表明本发明所提供的试剂盒具有良好的重复性。
[0061] 选择未检测出c反应蛋白的小牛血清进行加标回收实验，加入c反应蛋白标准 品，将C反应蛋白的浓度分别调整至 20pg/ml、lOOpg/ml、300pg/ml、500pg/ml、800pg/ml，空 白对照及每个浓度的样品均重复测定5次。各浓度的批内最大CVs为4. 1%，平均CVs为 3. 3%，各浓度的加标回收率为98. 9% -101. 5%，表明本发明所提供的试剂盒具有良好的 准确度。
[0062] 将本发明所提供的C反应蛋白近红外巧光检测试剂盒密封保存，并存放于4°C及 室温（25°C左右）下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。保存于4°C的试剂盒每周 取出4盒，分别检测0. 5pg/ml、0. 8pg/ml、l. 0pg/ml、l. 5pg/ml的C反应蛋白标准品；保存于 室温（25°C)的试剂盒每3天取出4盒，分别检测0. 5pg/ml、0. 8pg/ml、l. 0pg/ml、l. 5pg/ml 的C反应蛋白标准品。经验证，试纸盒在4°C下可保存20个月，且最低检出限和重复性没有 明显变化，在室温下可保存16个月，且最低检出限和重复性没有明显变化；在可保存的期 限内，试剂盒均可达到1.化g/ml的检测灵敏度。
[0063] 综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0064] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样 端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白单克隆 抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗C反应蛋白单克隆抗体包被的近红 外荧光乳胶微球颗粒。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白 单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体可以为相 同的抗C反应蛋白单克隆抗体，也可以为不同的抗C反应蛋白单克隆抗体。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为 140_160nm。
4. 如权利要求1-3任一权利要求所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方 法，包括如下步骤： 1) 用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液 中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗 粒上多余的基团，制备获得探针溶液； 2) 将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用； 3) 将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用； 4) 将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、 样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，再加入封闭液封闭乳 胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、 15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合； 和/或，步骤1制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0. l-20mg/ml ; 和/或，所述步骤1中，缓冲液为PBS缓冲液； 和/或，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11 : 0. 9-1. 1 ：0. 9-1. 1 ； 和/或，所述封闭液为乙醇胺。
6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，含有抗C反应蛋白单克 隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠 醚-6中的一种或多种的组合； 和/或，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0. l-20mg/ml ; 和/或，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度 为 1. 8-2. 2mg/ml ; 和/或，抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0. 9-1. lul/cm ; 和/或，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
7. 如权利要求1-3任一权利要求所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒在C反应蛋 白检测领域的用途。
8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述用途具体为使用所述C反应蛋白近红外 荧光检测试剂盒对样品中的C反应蛋白进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的 一种或多种的组合。
【专利摘要】本发明公开了一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明提供一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出人全血、血清或血浆中的C反应蛋白。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104865390
【申请号】CN201510292164
【发明人】郭焕杰, 李林
【申请人】上海凯创生物技术有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月1日