一种用于肝硬化的检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明创造设及生物技术领域，尤其设及一种用于肝硬化的检测试剂盒及其检测 方法。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体内蛋白质合成的主要场所，各种肝病均可影响蛋白质的合成功能，弓I 起多种血清蛋白浓度变化。肝硬化是一种常见的有不同病因引起的慢性、进行性、弥漫性肝 病，在肝细胞广泛变形和坏死基础上产生肝脏纤维组织弥漫性增生，肝脏硬化可W出现肝 细胞的合成功能障碍。肝硬化转换为肝癌几率的报道不尽相同，多数研究仍将肝硬化作为 肝癌发生的最大风险因素。因此对肝硬化的早发现、早诊断、早治疗十分重要，在肝硬化阶 段即进行介入预防，将有效降低肝硬化转向肝癌的发生率及死亡率。
[0003] 对于肝硬化的诊断方法现有技术中主要包括病理学、影像学和血清学诊断3种。 其中，肝组织穿刺病理检查仍是诊断肝纤维化及肝硬化的金标准，但在我国存在活检率低， 抽样误差，患者依存性差的缺陷，单次病理检查结果不能反应肝纤维化发展的动态过程，多 次复查缺乏可行性。由于早期肝硬化起病隐匿，临床表现往往缺乏特异性，因而敏感性很 差，此方法具有很大的滞后性。其中，影像学检查在临床一般采用B超及彩色多普勒超声检 查，CT、MR、内镜检查及X光食道胃底领餐造影。影像学对肝硬化晚期的诊断效果较好，对晚 期肝硬化消化道出血评估有积极的意义，但其区分轻度肝纤维化的效果则不理想。
[0004] 其中，血清学诊断根据酶联免疫法。血清多肤与蛋白质标志物在在化ISA检测方 法上仍存在诸多不足，尤其是多肤与蛋白标志物的联合检测尚处于简单的"混合型"模式。 ELISA检测方法中，最常使用双抗体夹屯、化ISA，该方法在血清多肤和蛋白进行联合检测 的研究中，一般将几种相关的，甚至无关联的蛋白或者多肤标志物分别检测，使可靠性大打 折扣。
[0005] 壳多糖酶3样1蛋白（CHI3L1)是一种含383个氨基酸的单体糖基化蛋白。目前 研究发现，在肝硬化患者的血清中，CHI3L1的浓度可显著性升高。因此，可根据人血清样本 中的CHI3L1含量用于肝硬化的诊断，设计一种相关检测试剂盒十分必要。
【发明内容】
[0006] 本发明创造要解决的问题是提供一种用于肝硬化的检测试剂盒，本发明提供的试 剂盒根据双抗体夹屯、法原理，可定量检测人体血清样本中CHI3L1的含量，快速、简便、准确 的确定检测结果。
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种用于肝硬化的检测试剂，包括W下试剂： CHI3L1微孔酶标板、CHI3L1检测抗体、HRP标记亲和素、HRP标记亲和素稀释液、CHI3L1样 本稀释液、显色剂A、显色剂B、洗漆液、终止液、校准品和质控品。
[000引进一步，所述显色剂A为含有双氧水的缓冲溶液，显色剂B为含有3, 3'，5, 5' -四 甲基联苯胺的缓冲溶液。
[0009] 进一步，所述CHI3L1微孔酶标板的微孔内包被有大鼠抗CHI3L1单克隆抗体，所述 CHI3L1微孔酶标板上设有8个微孔。
[0010] 进一步，所述CHI3L1检测抗体为生物素标记山羊抗CHI3L1多克隆抗体。
[0011] 本发明的第二个目的在于提供一种用于肝硬化的检测试剂盒，包括上述所有试 剂。
[0012] 进一步，还包括不干胶片。
[0013] 本发明的第S个目的在于提供一种用于肝硬化的检测试剂盒的检测方法，使用上 述的试剂盒，包括W下步骤：
[0014] (1)配置工作浓度的洗漆液，溶解校准品和质控品；
[0015] (2)稀释样本：待CHI3L1检测的血清样本用所述CHI3L1样本稀释液稀释，得稀释 样本；
[0016] 做依次将步骤（1)和似中的所述校准品、质控品、稀释样本加入到所述CHI3L1 微孔酶标板的微孔中，所述校准品和质控品进行复孔，混匀，得混匀后的酶标板；
[0017] (4)将步骤（3)中所述酶标板用所述不干胶片覆盖，置于37°C解育60分钟；
[001引 妨将步骤（4)中解育后的所述酶标板，弃不干胶片和酶标板的微孔内液体，采用 步骤（1)配置的所述工作浓度的洗漆液对酶标板的微孔进行洗漆，洗漆4次，或者采用洗板 机对所述酶标板的微孔进行洗漆，洗漆5次，拍干酶标板；
[0019] 做将步骤妨得到的干的酶标板加入所述CHI3L1检测抗体，用所述不干胶片覆 盖所述酶标板，置于37°C解育60分钟；
[0020] (7)利用步骤做得到的解育后的所述酶标板重复步骤妨中的洗漆操作，得拍干 的酶标板；
[0021] (8)使用HRP标记亲和素稀释液与HRP标记亲和素配置工作浓度HRP标记亲和素， 所述工作浓度HRP标记亲和素加入到步骤（7)得到的所述酶标板的微孔中，用所述不干胶 片覆盖所述酶标板，置于37°C解育30分钟；
[002引 （9)将步骤做得到的解育后的所述酶标板重复操作步骤妨中的洗漆操作，得拍 干的酶标板；
[002引 （10)配置显色剂；所述显色剂A;所述显色剂B按体积比1 ;1混合，得显色剂；
[0024] (11)将步骤（10)得到的所述显色剂加入到步骤（9)得到的所述酶标板的微孔中， 室温避光反应15分钟；
[0025] (12)将所述终止液加入到步骤（11)得到的所述酶标板的微孔内，混匀；
[0026] (13)将步骤（12)得到的所述酶标板采用酶标仪读取OD值。
[0027] 进一步，所述步骤（1)中所述洗漆液使用超纯水稀释，所述校准品和质控品使用 去离子水溶解，溶解后的所述校准品和质控品，于室温15分钟W上。
[002引进一步，步骤巧）中每次洗漆加入所述工作浓度的洗漆液需静置30~60秒，拍干 后再重新加所述工作浓度的洗漆液进行洗漆。
[0029] 本发明创造具有的优点和积极效果是：
[0030] 本发明创造的试剂盒应用抗人CHI3L1抗体包被微孔板，制成固相抗体，使用时往 包被抗体的微孔板中加入待检样本，若样本中含有被测物，便可结合于固相抗体上，从而