一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器的制备及应用
【专利说明】一种PdN i合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器的制备及应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器的制备及应用。具体是采用具有较好催化效果的氮掺杂石墨烯纳米带和PdNi合金，制备一种检测乳腺癌标志物的双重放大的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
【背景技术】
[0003]目前碳纳米管由于其独特的结构和优异的电学、力学以及光学等性能，在物理、化学、材料乃至生物领域备受关注。碳纳米管具有生物相容性可用作生物传感器、支架材料、药物载体等，已成为纳米生物学领域的研宄热点。氮掺杂的多壁碳纳米管除了具有上述的性质以外，其对双氧水还具有较好的催化性能。但是由于氮掺杂的多壁碳纳米管水溶性较差，因此对其进行了微波剥离，剥离后的多壁碳纳米管不仅保持了较好的催化性能，而且具有较好的水溶性。用其作为PdNi合金的载体，达到了信号双重放大的作用，降低分析物的检测限，从而提高检测的灵敏度。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是基于PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带构建的双重放大电化学免疫传感器。
[0005]本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器应用于乳腺癌肿瘤标志物的检测。
[0006]本发明的技术方案
1.一种PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带双重放大的免疫传感器的制备
(1)将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 Mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2-0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV ；
(2)取6μ?、0.5~3 mg/mL的卢-环糊精石墨稀的溶液滴加到电极表面，室温下瞭干；
(3)滴加6μ?、5~10 Pg/mL的金刚烷甲酸功能化的乳腺癌标志物的捕获抗体Ab1,4°C下晾干，超纯水冲洗；
(4)继续滴加3PU质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗；
(5)继续滴加6μ?的一系列不同浓度的乳腺癌标志物溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗；
(6)继续滴加4~6VL检测抗体孵化物一PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带-Ab2S液至电极表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器。
[0007]2.β_环糊精石墨烯的制备
6-12 mg的氧化石墨稀溶于20 mL的超纯水，60~100 mg的β -环糊精溶于20 mL的水中，两个溶液混合，加入200~600 μ L的氨水溶液和10~40 μ L水合肼；搅拌10 min，加热到60°C并且保持3.5 h，所得混合物经洗涤、离心分离、45°C下真空干燥，即制得β-环糊精石墨稀;
3.检测抗体孵化物一PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带_々132溶液的制备
(1)氮掺杂石墨烯纳米带的制备
将50 mg的氮掺杂的多壁碳纳米管、18 mU^H2S04、2 mL H3PCV混合，于50~140°C下微波反应4~30 min，冷却至室温；加入0.15~0.5 g的KMnO4，于60~70°C下微波反应2~10 min,混合物经洗涤、离心分离、35~45°C下真空干燥，制得氮掺杂石墨烯纳米带；
(2)检测抗体标记物一PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带的制备
分别将 15-25 mg 的 Na2PdCl4, 20-30 mg 的 NiCl2.6H20 和 50-60 mg 的谷氨酸置于 40mL的乙二醇中，用lmol/L的NaOH溶液调节溶液的pH为11，加入25~35 mg的氮掺杂石墨烯纳米带，搅拌1~3 h，移入反应釜中，100~200°C下反应2~8 h ;混合物经洗涤、离心分离、35°C下真空干燥，制得PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带；
(4)检测抗体孵化物一PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带_々132溶液的制备将1~3 mg的PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带分散于I mL超纯水中，加入100 μ L、8-12 μ g/mL的检测抗体溶液和900 μ L、1/15 mol/L的ρΗ=7.4磷酸盐缓冲溶液，在4°C下振荡孵化12 h，离心分离，将下层沉淀加入至I mL、l/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物一PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带-Ab2溶液，4°C下保存备用。
[0008]4.一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器用于乳腺癌标志物的检测，步骤如下:
(1)采用三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 S，记录电流变化；
(2)当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10 mL, pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10yL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化，绘制工作曲线；
6.本发明所述的一种PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带双重放大的免疫传感器的制备，所述乳腺癌标志物选自下列之一:CA153、CA125、CEA。
[0009]本发明的有益成果
(I)环糊精石墨烯具有较大的表面积和较好的导电性，以及良好的生物相容性和稳定性，另外，其能够特异性识别金刚烷甲酸功能化的捕获抗体，提高了抗体在其表面的负载量和在水中的分散性，增加了传感器灵敏度和稳定性。
[0010](2)将氮掺杂的石墨烯纳米带做为PdNi合金的载体，PdNi合金能够均匀分散在氮掺杂石墨烯纳米带上，提高传感器的灵敏度。并且氮掺杂的石墨烯纳米带具有较好的催化性能，从而达到双重放大的作用。
[0011](3)本发明制备的电化学免疫传感器用于乳腺癌标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，对乳腺癌标志物的检测限可达 0.22 pg/mL。
【具体实施方式】
[0012]实施例1乳腺癌标志物免疫传感器的制备
(1)将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 Mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2-0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV ；
(2)取6μ?、0.5 mg/mL的卢-环糊精石墨稀的溶液滴加到电极表面，室温下瞭干；
(3)滴加6μ?、5 Pg/mL的金刚烷甲酸功能化的乳腺癌标志物的捕获抗体Ab1,4°C下晾干，超纯水冲洗；
(4)继续滴加3PU质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗；
(5)继续滴加6μ?的一系列不同浓度的乳腺癌标志物溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗；
(6)继续滴加4VL检测抗体孵化物一PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带-Ab2S液至电极表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器。
[0013]实施例2乳腺癌标志物免疫传感器的制备
(1)将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 Mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2-0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV ；
(2)取6μ?、1.5 mg/mL的卢-环糊精石墨稀的溶液滴加到电极表面，室温下瞭干；
(3)滴加6μ?、7 Pg/mL的金刚烷甲酸功能化的乳腺癌标志物的捕获抗体Ab1,4°C下晾干，超纯水冲洗；
(4)继续滴加3PU质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗；
(5)继续滴加6μ?的一系列不同浓度的乳腺癌标志物溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗；
(6)继续滴加5VL检测抗体孵化物一PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带-Ab2S液至电极表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器。
[0014]实施例3乳腺癌标志物免疫传感器的制备
(1)将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 Mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2-0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV ；
(2)取6μ?、3 mg/mL的卢-环糊精石墨稀的溶液滴加到电极表面，室温下瞭干；
(3)滴加6μ?、10 Pg/mL的金刚烷甲酸功能化的乳腺癌标志物的捕获抗体Ab1,4 °〇下晾干，超纯水冲洗；
(4)继续滴加3PU质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗；
(5)继续滴加6μ?的一系列不同浓度的乳腺癌标志物溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗；
(6)继续滴加6VL检测抗体孵化物一PdNi合金/氮掺杂石墨稀纳米带-Ab2S液至电极表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器。
[0015]实施例4 环糊精石墨烯的制备
6 mg的氧化石墨稀溶于20 mL的超纯水，60 mg的β-环糊精溶于20 mL的水中，两个溶液混合，加入200 μ L的氨水溶液和10 μ L水合肼；搅拌10 min,加热到60°C并且保持
3.5h，所得混合物经洗涤、离心分离、45°C下真空干燥，即制得β-环糊精石墨烯；
实施例5 β-环糊精石墨烯的制备
8 mg的氧化石墨稀溶于20 mL的超纯水，80 mg的β-环糊精溶于20 mL的水中，两个溶液混合，加入400 μ L的氨水溶液和20 μ L水合肼；搅拌10 min,加热到60°C并且保持
3.5h，所得混合物经洗涤、离心分离、45°C下真空干燥，即制得β-环糊精石墨烯；
实施例6 β-环糊精石墨烯的制备
12 mg的氧化石墨稀溶于20 mL的超纯水，100 mg的β-环糊精溶