有H-IgG蛋白的芯片放到SPRi仪器上，扫描共振角，并记录，见图4。
[0256] (6)调整光学位置为20. 2,通入50微克/毫升靶标蛋白G-H-IgG的PBS溶液，记 录背景信号变化以及结合和解离曲线，见图5。
[0257] 上述试验中，由图4可以看出，将功能化的高分子铺在SA表面并清洗之后，共振角 向右偏移，说明功能化的高分子在表面固定成功；然后，将模式蛋白H-IgG在芯片上孵育并 清洗之后，共振角度继续向右偏移，说明蛋白在表面固定成功。
[0258] 上述实验中，由图5可以看出，本发明所制备三维生物表面可以成功固定生物大 分子，并用来检测与靶标蛋白的相互作用，并且具有背景小，信号强度大，信噪比高的特点。
[0259] 实施例9使用实施例1所得三维生物表面对药物小分子雷帕霉素的固定
[0260] 雷帕霉素是一种新型大环内酯类免疫抑制剂。雷帕霉素通过不同的细胞因子受体 阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应。 它与蛋白FKBP12的相互作用具有重要的研宄意义。利用本发明所述三维表面，可以在其上 固定雷帕霉素，并利用表面等离子基元成像（SPRi)技术，来表征雷帕霉素的成功固定。
[0261] 具体步骤如下：
[0262] (1)用移液枪量取0. 5微升，10mM的雷帕霉素/二甲基亚砜溶液，轻轻点一滴，在 实施例1中步骤（19)所得芯片表面。
[0263] (2)重复上述操作20次，可以在芯片表面制备4X 5的雷帕霉素液滴矩阵。
[0264] (3)将步骤⑵所制备芯片，放入真空干燥箱，干燥1小时。
[0265] (4)干燥后将步骤（3)所得芯片在365纳米紫外光下照射10分钟，光强为lj/cm2， 进tx光交联。
[0266] (5)将步骤⑷所制备芯片置于20毫升N，N_二甲基甲酰胺溶液内，摇洗15分钟。
[0267] (6)将步骤（5)所制备芯片置于20毫升去离子水内，摇洗15分钟。
[0268] (7)将步骤（6)所制备芯片置于20毫升乙醇内，摇洗15分钟。
[0269] (8)用氮气吹干步骤（7)所制备芯片，既得本发明所要求的技术。
[0270] 将上述技术所制备的小分子（雷帕霉素）微阵列芯片置于表面等离子基元像生物 传感器上，观察雷帕霉素在芯片表面的固定情况。结果如图7所示，雷帕霉素在实施例1所 得三维生物表面成功固定。
[0271] 实施例10使用实施例3所得三维生物表面对模式蛋白H-IgG的固定
[0272] 与实施例8类似，使用实施例3所得三维生物表面对模式蛋白的固定步骤如下：
[0273] (1)将实施例3中步骤（7)所得的三维生物表面用乙醇/水交替清洗，氮气吹干。
[0274] (2)将步骤（1)所清洗的三维生物表面浸入15毫升，0.4M的N-羟基琥珀酰亚胺 溶液和0. 1M的1-乙基_(3_二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的混合溶液中，室温反应 15分钟。
[0275] 取出上述生物表面，清洗，在其表面手动点上50微克/毫升的蛋白H-IgG，4°C下放 置2小时。既得本发明所述生物芯片。
[0276] 实施例11使用实施例3所得三维生物表面对药物小分子雷帕霉素的固定
[0277]与实施例9类似，使用实施例3所得三维生物表面对药物小分子雷帕霉素的固定 如下：
[0278] 具体步骤如下：
[0279] (1)用移液枪量取0. 5微升，10mM的雷帕霉素/二甲基亚砜溶液，轻轻点一滴，在 实施例1中步骤（19)所得芯片表面。
[0280] (2)重复上述操作20次，可以在芯片表面制备4X 5的雷帕霉素液滴矩阵。
[0281] (3)将步骤⑵所制备芯片，放入真空干燥箱，干燥1小时。
[0282] (4)干燥后将步骤⑶所得芯片在365纳米紫外光下照射10分钟，光强为lj/cm2， 进tx光交联。
[0283] (5)将步骤⑷所制备芯片置于20毫升N，N_二甲基甲酰胺溶液内，摇洗15分 钟。
[0284] (6)将步骤（5)所制备芯片置于20毫升去离子水内，摇洗15分钟。
[0285] (7)将步骤（6)所制备芯片置于20毫升乙醇内，摇洗15分钟。
[0286] (8)用氮气吹干步骤（7)所制备芯片，既得本发明所要求的技术。
[0287] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程， 但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细 工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进， 对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的 保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种=维生物表面，所述=维生物表面包括链霉亲和素包被的基底，其特征在于： 所述=维生物表面还包括生物素和通过生物素与所述链霉亲和素包被的基底结合的功能 化的抗非特异性吸附材料，在所述=维生物表面中，未与所述功能化的抗非特异性吸附材 料结合的生物素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的摩尔比是1 ;(〇~ 12500)。2. 根据权利要求1所述的=维生物表面，其特征在于：所述抗非特异性吸附材料是支 链含哲基末端的高分子； 优选地，所述支链含哲基末端的高分子是聚己二醇、聚己二醇的衍生物或者支链含哲 基的含氣聚合物； 优选地，在所述=维生物表面中，未与所述功能化的抗非特异性吸附材料结合的生物 素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的摩尔比优选1 ; (0~5000)，更优 选 1 ;1000。3. 根据权利要求1或者2所述的=维生物表面，其特征在于：所述功能化是指酸化或 者醋化。4. 权利要求1-3中任一项所述的=维生物表面的制备方法，所述制备方法包括W下步 骤： (1) 合成生物素化的引发剂； (2) 将所述生物素化的引发剂和生物素固定在链霉亲和素包被的基底上，所述生物素 化的引发剂和生物素的摩尔比为1 ; (0~12500); (3) 利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而在所述链霉亲和素包被的基底上生 成抗非特异性吸附材料； (4) 使所述抗非特异性吸附材料功能化； 任选地，所述制备方法包括W下步骤： (1 ^ )合成生物素化的引发剂； (2 ^ )利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而合成生物素化的抗非特异性吸 附材料； (3 ^ )将所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素接枝到链霉亲和素包被的基 底上，所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素的摩尔比为1 ; (0~12500); (4 ^ )使所述抗非特异性吸附材料功能化。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于；所述生物素化的引发剂的合成方法 包括W下步骤： (a)将生物素活化；将酷胺化反应活化剂、有机碱类催化剂分别加入生物素的有机溶 剂中，在5°C~60°C下揽拌，酷胺化反应活化剂、生物素、有机碱类催化剂之间的摩尔比是 1 ; (0. 5 ~5) ; (1 ~10)，优选 1 ; (0. 5 ~2) ; (1 ~5)，更优选 1:1:1. 5 ; 化）将活化后的生物素酷胺化；将单边保护的双氨基末端试剂加入步骤（a)所得的溶 液中，在5°C~60°C下揽拌，所述单边保护的双氨基末端试剂与所述活化后的生物素的摩 尔比为（10~1):1，优选巧~1):1，更优选2:1; (C)纯化步骤化）所得的酷胺化的生物素； (d)将上述步骤（C)所得产物进行去单边保护； (e) 将引发剂活化；将酷胺化反应活化剂、有机碱类催化剂分别加入引发剂的有机溶 剂中，在5°C~60°C下揽拌，所述酷胺化反应活化试剂、所述引发剂、所述有机碱类催化剂 的摩尔比为1 ; (0. 5~5) ; (1~10)，优选1 ; (0. 5~2) ; (1~5)，更优选1:1:1. 5 ; (f) 将活化的引发剂生物素化；将步骤（d)所得产物与步骤（e)所得产物进行反应，后 者的摩尔量与前者摩尔量的比例为（10~1) : 1，优选巧~1) : 1，更优选2:1 ; (g) 纯化步骤（f)所得的生物素化的引发剂； 优选地，在步骤（2)中所述生物素化的引发剂和生物素的摩尔比优选为1 ;(0~ 5000)，更优选 1 ; 1000 ; 优选地，在步骤（3 ^ )中所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素的摩尔比优选 为 1 ; (0 ~5000)，更优选 1 ; 1000。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述生物素化的引发剂的结构 为其中，R为碳、氮和氧S种元素所形成的末端为-NH-的直链烷基，优选C3~CIO的直 链烷基，X为面素； 优选地，所述直链烷基为-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-或-NH-CH2-CH2-O-CH2-C&-NH-; 进一步优选地，所述生物素化的引发剂为7. 根据权利要求5或者6所述的制备方法，其特征在于：所述酷胺化反应活化剂是 N，N' -二班巧酷亚胺基碳酸醋或者1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐； 优选地，所述有机碱类催化剂是S己胺或者4-二甲氨基化晚； 优选地，所述有机溶剂是N，N-二甲基甲酯胺、四氨快喃或者二甲基亚讽中的任意一种 或者至少两种的混合物； 优选地，所述单边保护的双氨基末端试剂是N-叔了氧幾基-2-[2-(2-氨基-己氧 基）-己氧基]-己醇胺或者N-叔了氧幾基-2- (2-氨基-己氧基）-己醇胺； 优选地，步骤（C)与步骤（g)中的纯化方法是柱层析、重结晶或者过滤。8. 根据权利要求4-7中的任一项所述的制备方法，其中，步骤（4)和（4 ^ )的功能化 方法独立地是酸化或者醋化； 优选地，所述酸化方法是将酸酢类酸化剂和碱性催化剂溶解在有机溶剂中，然后铺在 所述抗非特异性吸附材料的表面上，室温反应1~50h; 优选地，所述醋化方法是将步骤（3)或者（3 ^ )得到的固定了抗非特异性吸附材料 的链霉亲和素包被的基底放入含小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，在 18~32°C的反应温度下反应1~40小时。9. 一种S维生物巧片，其特征在于：所述S维生物巧片包括权利要求1-3中任一项所 述的=维生物表面和与所述=维生物表面结合的配体； 优选地，所述配体为生物大分子或者药物小分子。10. 权利要求9所述的S维生物巧片在祀标垂钓中的用途； 优选地，所述祀标是抗原、抗体和核酸。
【专利摘要】本发明提供了一种三维生物表面及其制备方法以及包括该三维生物表面的三维生物芯片及其用途，所述三维生物表面包括链霉亲和素包被的基底，其特征在于：所述三维生物表面还包括生物素和通过生物素与所述链霉亲和素包被的基底结合的功能化的抗非特异性吸附材料，在所述三维生物表面中，未与所述功能化的抗非特异性吸附材料结合的生物素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的摩尔比是1：(0～12500)，该三维生物表面适用于SA基底，能增加生物大分子固定量，具有优良的抗非特异性吸附能力并且可以在商业化SA基底上固定药物小分子。
【IPC分类】G01N33/53, C12Q1/68, G01N33/543
【公开号】CN104931687
【申请号】CN201510163388
【发明人】朱劲松, 王瑞, 杨墨, 程志强, 李少鹏, 周文菲
【申请人】国家纳米科学中心
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年4月8日