复合物特异性抗体和抗体片段及其用图
【专利说明】复合物特异性抗体和抗体片段及其用途
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求于2012年8月20日提交的美国临时申请序列号61/684,836号的权 益，其全部内容并入本文以供参考。
【背景技术】
[0003] 制药产业对免疫球蛋白例如抗体有着持续并增长的兴趣。自2000年以来，单克隆 抗体的治疗市场已呈指数增长，在2007年，在美国最畅销的20种生物技术药物中有8种为 治疗性单克隆抗体，每一种在全世界都有超过50亿美元的年销售额。
[0004] 目前，显著数量的抗体以及免疫球蛋白的衍生物和片段正处于临床前和临床研宄 阶段中。在进入人体之前，所研宄的药物必须在广泛的探宄和临床前试验中进行分析和表 征。需要研宄例如毒理学、药代动力学和药效动力学特征等重要指标，以建立安全且有效的 药物信息（drug profile)。为了量化和监测治疗性抗体的水平，许多这类的研宄需要使用 药物特异性试剂，以在样品基质（sample matrix)例如病人或实验动物的血清或任意体液 中特异地检测治疗性抗体。
[0005] 药物特异性试剂包括，例如，仅检测人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白且因此其 可用于对源自非人实验宿主的样品中的人治疗性抗体或人源化治疗性抗体进行定量的抗 体（见例如冊2006066912山5序列号11/792,910，其全部内容并入本文以供参考）。进一 步的是使用抗独特型抗体（anti-idiotypic antibodies)或抗体片段，其特异于治疗性抗 体中的独特结构。因此，抗独特型抗体可用于检测样品基质中特定的治疗性抗体或抗体片 段，而与样品所分离自的宿主无关（见，例如W02009032128)。然而，因为绝大部分的抗独特 型抗体结合至治疗性抗体的独特CDR的一个或多个，且所述的CDR定义了特异地与治疗性 抗体的抗原相互作用的互补位（paratope)，所以只有对游离的、非与抗原结合的治疗性抗 体的检测和监测是可能的。
[0006] US 2012/0157663描述了所谓的"domino抗体"，其具有仅当在抗体结合到各自的 抗原上时才与所述抗体相结合的能力。US2012/0157663的抗体通过一种特定的基于杂交瘤 的筛选技术产生。所有domino抗体的共同点是，祀抗体上的domino抗体的表位通过革巴抗 体与其各自的抗原相结合时所引起的构象变化形成。所述表位位于靶抗体的恒定区（例如 轻链的恒定区），且既不包括抗原的任何部分，也不包括所述靶抗体的⑶R区。相比之下， 本发明的复合物特异性抗体和抗体片段结合至靶抗体CDR区的至少某些部分。因此，尽管 domino抗体仅在祀抗体结合其各自的抗原时识别祀抗体，domino抗体也与具有相同的抗 原特异性的其它靶抗体相结合，即它们在这个方面是泛特异性的。相比之下，本发明的抗体 和抗体片段特异于一种单一的靶抗体，且其仅在靶抗体结合其抗原时与此靶抗体结合。
[0007] 因为应用到患者的治疗性抗体总是在宿主身体周围中的不同状态之间平衡，因此 对于这些不同状态的监控和均衡化（proportion)为治疗性抗体的安全性提供了必须的信 息。这些不同的状态根据质量作用定律平衡，包括总抗体、未结合抗体和结合抗体，且所述 的平衡取决于，例如治疗性抗体的亲和性以及体内抗原的浓度。此外，由于治疗性抗体相对 较慢的体内清除率，与其抗原相结合的治疗性抗体在长期的施用中通常导抗原水平的增加 (Charles P. (1999)Journal of Immunology 163 ;1521_1528)。在治疗性抗体的存在下，结 合的抗原被中和，且其大多数不具生物活性。然而，必须监测这种现象，并且例如评估突然 停药的风险很重要。
[0008] 对于治疗性抗体的剖析（profiling)和稍后的批准来说，综合总抗体、 未结合抗体和结合抗体的特异性检测是尤受关注和重要的（Kuang B. (2010) Bioanalysis, 2(6) : 1125-40)。仅例示出一些抗独特型抗体有能力结合未结合的治疗性 抗体并且还能结合复合物（治疗性抗体结合至其抗原），并因此可用以检测总抗体负载 (total antibody load)。这种非互补位（non-paratopic)抗独特型抗体在 W02009032128 中公开。
[0009] 相比之下，几乎所有的抗独特型抗体都针对靶抗体的⑶R，且因此仅检测未结合的 抗体（见例如 Tornetta M. (2007) Journal of Immunological Methods 328,34-44)。
[0010] 然而，无论是使用⑶R特异性抗独特型抗体，还是使用非互补位抗独特型抗体，都 无法仅为药物-抗原复合物提供直接检测和定量。为了量化结合的抗体，建立了多种基于 ELISA的测定法，但往往需要使用二级抗体，例如抗人Fc，以进行间接检测。使用Fc特异性 检测抗体需要额外的步骤以及充分的洗涤，以由血清免疫球蛋白中捕获和分离复合物，因 此这些测定法容易受到背景噪音和信号变化的影响。
[0011] 因此，需要更为灵敏和稳健的替代方法来检测和定量抗体-抗原复合物。
【发明内容】
[0012] 本发明公开了这样的抗体及抗体片段，其特异性地检测和结合关联抗体（cognate antibody)与其抗原的复合物。本公开的抗体并不与所述的关联抗原结合部分或所述的 抗原单独结合，并因此可用于直接检测结合的治疗性抗体，而不需要使用二级Fc特异性抗 体。
[0013] 本发明还公开了这样的抗体及抗体片段，其特异性地检测和结合特异性关联抗体 与其抗原的复合物。具体地，本发明的抗体和抗体片段不与具有相同抗原特异性的其它关 联抗体的复合物结合。
[0014] 这些复合物特异抗体提供了优越的对从人类患者或实验动物中分离的样品中的 抗体-抗原复合物以及游离或未结合的药物进行定量的方法。在本文中公开了更灵敏且更 稳健的测定法，例如ELISA体系（set-up)，为药代动力学提供替代的和改进的测定法。此 外，可使用本文公开的定量测定法开发护理点测试（point of care tests)，使用例如横向 流动技术（lateral flow techniques)以监测药物水平。
[0015] 本公开进一步公开了所述抗体在用于检测所述复合物的测定中的用途。此外，本 公开内容公开了鉴定特异性地检测特异性关联抗体与其抗原的复合物的抗体的方法。
【附图说明】
[0016] 图1示出了在ELISA中针对一系列不相关和相关的抗原以及阿达木单抗 (Adalimumab) /TNF- a复合物测试7个抗体的特异性结合的结果。每种抗原以5 y g/mL涂 覆在微量滴定板上过夜。在使用5% BSA洗涤和封闭后，加入Fab-Hl形式（format)(来自 2 yg/mL溶液中的20 yL)的抗阿达木单抗/TNF- a抗体。使用HPR标记的抗His抗体和 QuantaBlu荧光过氧化酶底物进行检测。
[0017] 图2示出了在ELISA中AdaTNF#5对于不同的固定化抗原的滴定结果。在测试的 浓度范围（0. 03-2000ng/mL)内，AdaTNF#5只与阿达木单抗/TNF-a复合物结合，但并不与 其单一组分和其它抗原结合。
[0018] 图3示出了在ELISA中转换为全长人IgGl的纯化AdaTNF#5针对不同抗原的测试 结果。结合HRP的纯化AdaTNF#5-hIgGl特异性地与阿达木单抗和TNF-a的复合物结合。 [0019] 图4示出了药代动力学ELISA分析的结果。将人TNF-a涂覆在微量滴定板上，将 增加浓度的阿达木单抗掺入10%人类血清，并将其涂覆到预涂覆板。在洗涤后，以2yg/ml 添加抗阿达木单抗/TNF-ahlgGl抗体AdaTNF#5 (结合至HRP)。通过添加QuantaBlu'?荧 光过氧化酶底物进行检测。在人类血清的存在下，AdaTNF#5以剂量依赖的方式结合阿达木 单抗/TNF-a复合物。
[0020] 图5示出了在ELISA中IFX-TNF#1、IFX-TNF#2和IFX-TNF#3针对多种抗原的测试 结果。因此，将5yg/mL每种抗原涂覆在微量滴定板上，加入Fab-Hl形式（来自2yg/mL 溶液中的20 yL)的抗英夫利昔单抗（Infliximab)/TNF-a抗体。已证明IFX-TNF#1特异 性地检测抗英夫利昔单抗/TNF- a复合物（图5)。
[0021] 图6示出了筛选ELISA以检测抗M0R103/GM-CSF复合物抗体的结果。将5yg/mL 的每种抗体（BSA、GST、M0R03207和M0R103)涂覆在微量滴定板上。此外，M0R103/GM-CSF复 合物还固定化在该板上。M103GmCSF#l、M103GmCSF#2和M103GmCSF#3特异性地检测M0R103/ GM-CSF复合物，但不单独检测GM-CSF或M0R103。
[0022] 图7示出了测试M103GmCSF#l的靶标选择性的ELISA测试结果。将单独的M0R103、 生物素化GM-CSF或结合M0R103的生物素化GM-CSF涂覆到抗生物素蛋白涂覆板上。以增 加的浓度加入His标记的M103GmCSF#lFab并进行检测。M103GmCSF#l显示出结合药物-靶 复合物而不结合单独蛋白质（药物和靶）的高选择性。
[0023] 图8示出了基于MSD?(MesoScaleDiscovery)配体结合测定法以定量人 类血清中的M0R103/GM-CSF复合物的结果。M0R103/GM-CSF复合物补充有人血清，并在 Multi-array?_96孔板标准板上进行滴定。使用ECL标记的M103GmCSF#lIgG检测M0R103/ GM-CSF复合物。在整个滴定曲线中，M0R103/GM-CSF复合物在50 %人类血清的存在下以剂 量依赖的方式被特异性地检测。
【具体实施方式】
[0024] 因此，在一个方面，本公开涉及分离的单克隆抗体或其片段，其特异性地结合至特 异性关联抗原结合部分与其抗原的复合物。在一个实施方式中，分离的单克隆抗体或其片 段特异性地结合至特异性关联抗原结合部分与其抗原的复合物，且不单独与所述关联抗原 结合部分或所述抗原结合。
[0025] 分离的单克隆抗体或其片段
[0026] 在另一方面，本公开涉及一种分离的单克隆抗体或其片段，其中所述分离的单克 隆抗体或其片段特异性地结合至特异性关联抗原结合部分与其抗原的复合物，且EC 5(I浓度 为小于 lOOnM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、 4nM、3nM、2nM 或 InM。
[0027] 在另一方面，本公开涉及一种分离的单克隆抗体或其片段，其中所述分离的单克 隆抗体或其片段特异性地结合至特异性关联抗原结合部分与其抗原的复合物，且解离常数 (心）为小于1\10 7]^1、108]^1、109]^ 1、101°]^1、1011]^1、10 12]^1或1013]^1。
[0028] 在一个方面，本公开涉及一种分离的单克隆抗体或其片段，其中所述分离的单克 隆抗体或其片段是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方式中，所述分离的抗体或其片 段是人抗体或人源化抗体。在一个实施方式中，所述分离的抗体或其片段是嵌合抗体。在 一个实施方式中，所述分离的抗体或其片段包括人重链恒定区和人轻链恒定区。在一个实 施方式中，所述分离的抗体为IgG同种型。在另一个实施方式中，抗体可为任意同种型（例 如 IgG、IgE、IgM、IgD 和 IgA)、类（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或其衍生物 (例如IgGlf LALA)。在一个实施方式中，所述抗体为IgGlf LALA同种型。在一个实施方 式中，所述分离的抗体或其片段选自？&13、？(&&2)'、？( &13)2'或8(^￥。在一个实施方式中， 所述分离的抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成抗体。在一个 实施方式中，所述的抗体或其片段为人抗体或人源化抗体。
[0029] 关联抗原结合部分
[0030] 在一方面，本公开涉及一种分离的单克隆抗体或其片段，其特异性地结合至关联 抗原结合部分与其抗原的复合物。在另一方面，本公开涉及一种分离的单克隆抗体或其片 段，其特异性地结合至特异性关联抗原结合部分与其抗原的复合物。在一个实施方式中，所 述关联抗原结合部分或所述特异性关联抗原结合部分为关联抗体或其片段。在一个实施方 式中，所述关联抗体或其片段、或所述特异性关联抗体或其片段为治疗性抗体或治疗性抗 体片段。在另一个实施方式中，所述关联抗体或其片段、或所述特异性关联抗体或其片段为 诊断性抗体或诊断性抗体片段。
[0031] 在一个优选的实施方式中，所述关联抗体或其片段为特异性关联单克隆抗体或其 片段。"特异性关联单克隆抗体"意指一种，且仅有一种与其抗原特异性地结合的单克隆抗 体。所谓的"domino抗体"（见US 2012/0157663)的靶抗体在此定义下并非特异性关联抗 体，因为domino抗体与其祀抗体的恒