Acore T200)进行检测。
[0039]材料
CM5 芯片，Cat.N0.BR-1005-30 (GE Healthcare)；
NHS:100 mM N-羟基琥珀酰亚胺；
EDC:400 mM 二甲基氨基丙基乙基碳酰胺；
HBS-EP缓冲液；
乙醇胺:1 M乙醇胺，pH 8.5 ;
纯化花生Ara hi蛋白:纯度>90%，1.0 mg/mL，保存在PBS缓冲液中；
纯化抗花生Ara hi单克隆抗体5G4:纯度>90%，1.8 mg/mL，保存在PBS缓冲液中； 纯化抗花生Ara hi多克隆抗体:纯度>90%，1.0 mg/mL，保存在PBS缓冲液中；
方法
纯化抗花生Ara hi单克隆抗体5G4的固定
用氨基偶联的方法将纯化抗花生Ara hi单克隆抗体5G4固定在CM5芯片上:
表面平衡=HBS-EP缓冲液，以10 μ L/min的流速平衡芯片表面5min ；
表面活化:注射“NHS + EDC” 1:1混合液，以10 μ L/min的流速活化芯片表面7min ；偶联:注射纯化抗花生Ara hi单克隆抗体5G4 (稀释在10 mM醋酸钠，pH 4.5缓冲液中)，以10 μ L/min的流速偶联7 min ；
表面封闭:注射乙醇胺，以10 μ L/min的流速封闭表面7 min。
[0040]抗体灵敏度检测
用 HBS-EP 缓冲液将纯化花生 Ara hI 蛋白稀释为 5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL进行检测，所有浓度均重复以下过程:
以5 μ L/min的流速注射一定浓度的纯化花生Ara hi蛋白300 s ；
以5 μ L/min的流速注射HBS-EP缓冲液180 s平衡表面；
以5 μ L/min的流速注射0.3mg/mL纯化抗花生Ara hi多克隆抗体用于放大信号；
以30 μ L/min的流速注射1mM Glycine-HCl (pH 2.0)30 s，3次用于再生纯化抗花生Ara hi单克隆抗体5G4的表面。
[0041]在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代一定浓度的纯化花生Ara hi蛋白作为样本零浓度(n=5)用来检测LOD (即最低检测限:背景信号下能够检测出的被检物的最低浓度；计算方法为样本零浓度信号平均值SD的三倍)。
[0042]通过上述建立起的SPR检测花生主要过敏原Ara hi蛋白的方法，抗花生Ara hi单克隆抗体的LOD为2.58ng/mL ;抗花生Ara hi多克隆抗体的LOD为0.77ng/mL，相比于其他方法，本发明方法最大的优势在于无需对样品进行标记，检测方便、快捷、灵敏度高、并且可以多次利用，样品需要的量极少，能高通量、高质量地分析数据。
[0043]本发明利用抗原抗体专一识别的原理，结合SPR高效、准确、快速的优点对花生的主要过敏原Ara hi蛋白进行检测。与现有技术相比，本发明的核心改进之处在于通过SPR技术，利用高效价的抗花生Ara hi单克隆抗体作为固定抗体，捕抓花生Ara hi蛋白，再通过抗花生Ara hi多克隆抗体进行信号放大，快速高效进行检测花生主要过敏原蛋白。这种方法同时结合了双抗体夹心ELISA方法的特异性和SPR快速高效的特征，从而达到高效、准确、便捷的检测效果。
[0044]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，包括步骤: A、制备花生Arahi蛋白； B、以花生Arahi蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗花生Ara hi多克隆抗体； C、以花生Arahi蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗花生Ara hi单克隆抗体； D、通过偶联的方法将抗花生Arahi单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的花生Ara hi蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗花生Ara hi多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。2.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤A具体包括:对花生进行丙酮去脂处理，然后通过PBS缓冲液对去脂后的花生进行花生蛋白提取，得到花生蛋白粗提液，最后通过硫酸铵分级沉淀及阴离子交换层析法分离出花生蛋白粗提液中的花生Ara hi蛋白。3.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤B具体包括:以花生Ara hi蛋白作为抗原，将花生Ara hi蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，冋时将花生Ara hi蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后夹动物眼球取血，离心取血清，制得抗花生Ara hi多克隆抗体。4.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤B之后还包括:对抗花生Ara hi多克隆抗体进行效价测定、纯化及特异性测定。5.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤C具体包括:以花生Ara hi蛋白作为抗原，将花生Ara hi蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将花生Ara hi蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后取免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞混合，通过PEG法进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行筛选与克隆，制得抗花生Ara hi单克隆抗体。6.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤C还包括对抗花生Ara hi单克隆抗体进行纯化处理，所述纯化处理具体包括:用花生Arahi蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应，取阳性杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成I X 106/mL，接种动物腹腔每只0.5mL，待8?1d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，纯化腹水，得到两株抗花生Ara hi单克隆抗体。7.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤C还包括采用免疫印迹法对抗花生Ara hi单克隆抗体进行鉴定，并采用不同的抗IgG类型单抗对抗花生Ara hi单克隆抗体进行抗体类型测定。8.根据权利要求1所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤D具体包括步骤: D1、将抗花生Ara hi单克隆抗体固定于检测芯片上； D2、以3~7 μ L/min的流速注射花生Ara hi蛋白流经检测芯片280~320s ； D3、以3~7 μ L/min的流速注射HBS-EP缓冲液平衡检测芯片表面150~200s ； D4、以3~7 μ L/min的流速注射抗花生Ara hi多克隆抗体用于放大信号； D5、以 25~35yL/min 的流速注射8~10mM Glycine-HCl 25~35s，3 次用于抗花生Ara hi单克隆抗体的表面； 在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代花生Ara hi蛋白作为样本零浓度用来检测 LOD09.根据权利要求8所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤Dl中，所述抗花生Ara hi单克隆抗体的固定具体包括步骤: Dl1、注射HBS-EP缓冲液，以8~12 μ L/min的流速平衡检测芯片表面4~7min ； D12、注射NHS与EDC的混合液，以8~12 μ L/min的流速活化检测芯片表面5~10min ； D13、注射抗花生Ara hi单克隆抗体，以8~12 μ L/min的流速偶联检测芯片5~10min ； D14、注射乙醇胺，以8~12 μ L/min的流速封闭检测芯片表面5~10 min。10.根据权利要求8所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤 D2 中，用 HBS-EP 缓冲液将花生 Ara hI 蛋白稀释为 5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL的不同浓度的花生Ara hi蛋白。
【专利摘要】本发明公开一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，具体通过分别制备抗花生Ara？h1单克隆抗体和抗花生Ara？h1多克隆抗体，然后通过偶联的方法将抗花生Ara？h1单克隆抗体固定在检测芯片上，将不同浓度的花生Ara？h1蛋白流经检测芯片，加入抗花生Ara？h1多克隆抗体用于放大信号，从而达到快速高效检测花生主要过敏原蛋白的目的。本发明方法具有灵敏度高、准确度高、检测快捷等特点，可成为花生过敏原检测的重要技术手段。
【IPC分类】G01N33/558
【公开号】CN105044334
【申请号】CN201510376281
【发明人】吴序栎, 刘志刚, 何伟逸, 李瑶
【申请人】深圳大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月1日