循环肿瘤细胞染色：对捕获的循环肿瘤细胞在固定、透膜后进行CK(骨架蛋 白）、CD45 (白细胞表面特异性抗原）、细胞核染色或在细胞不固定的情况下对CD45和第二 单链多核巧酸进行染色；
[00巧]4)循环肿瘤细胞计数：在显微镜下观察分析巧光图像，将CK+/CD45-/DAPI+的细 胞或CD45-/第二单链多核巧酸+的细胞鉴定循环肿瘤细胞并计数。 阳0%] 进一步的，所述步骤3)中所述CKXD45、细胞核的染色通过固定细胞染色剂染色， 所述固定细胞染色剂包括FITC标记的anti-CK、APC标记的anti-CD45和核染色剂DAPI溶 液，对循环肿瘤细胞的CK(骨架蛋白）、CD45(白细胞表面特异性抗原）和细胞核染色。S 者巧光显色不同，可W对标记物加W识别，区分循环肿瘤细胞、白细胞和无核红细胞等其他 背景信号。
[0027] 进一步的，所述步骤3)中所述第二单链多核巧酸和CD45的染色通过不固定细 胞染色剂染色，所述不固定细胞染色剂包括切3标记的第一单链多核巧酸和APC标记的 anti-CD45。两者巧光显色不同，可W对标记物加W识别，排除白细胞的干扰。
[0028] 应理解，在本发明范围内中，上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述 的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，限于篇幅，在此不再 累述。
[0029] 检测过程大致为样本与细胞识别探针共解育，细胞识别探针负载到循环肿瘤细胞 上形成细胞悬液，将其W-定的流速通过微流体通道表面，因微通道表面负载有捕获探针， 取向自由，捕获探针与细胞识别探针特异性结合从而捕获到循环肿瘤细胞，再进一步对捕 获的循环肿瘤细胞进行染色计数实现循环肿瘤细胞的检测。
[0030] 本发明提供的技术方案能够对PDMS基片W及载玻片同时进行负载，且忍片具有 很长保质期。其方法是通过化学修饰使PDMS基片与载玻片构成的微流体通道表面形成氨 基，然后修饰上第一单链多核巧酸，并将与第一单链多核巧酸互补的第二单链多核巧酸标 记在循环肿瘤细胞的识别抗体上，待实验室将抗体/第二单链多核巧酸复合物通过微流体 通道，通道表面的第一单链多核巧酸就能够转化为抗体，从而进行循环肿瘤细胞的捕获。试 剂盒中的忍片上由于只负载单链多核巧酸因而能够较长期的保存。
[0031] 与现有技术相比，本发明存在W下优点：
[0032] 1.微通道表面负载捕获探针，另外表面具有周期性凹凸结构，能够增加细胞与微 流体通道表面碰撞几率，运样大大提高了细胞的捕获效率；
[0033] 2.由于修饰了多核巧酸的微流控忍片在低溫或者室溫且一定的真空条件或者氮 气保护下可长期保存，与现有修饰抗体或亲和素的忍片相比保存更容易，保存时间更长；
[0034] 3.循环肿瘤细胞的捕获与检测集成到一个试剂盒中，配合自动化的设备，使得循 环肿瘤细胞的捕获与检测能够自动化完成。
[0035] 4.两种细胞染色的方式W区分循环肿瘤细胞与其他细胞（主要是白细胞），一种 是传统的对细胞先固定、后透膜、再进行免疫巧光染色的方式，另一种是在不固定细胞的前 提下直接对细胞进行染色，即活细胞染色，运一方式尤其适用于要对循环肿瘤细胞基因检 测的情形。
【附图说明】
[0036] 图1是本发明所述循环肿瘤细胞检测试剂盒一【具体实施方式】结构示意图；
[0037]图2是本发明所述微流控忍片一【具体实施方式】的结构示意图；
[0038] 图3是本发明所述PDMS基片一【具体实施方式】的结构示意图；
[0039] 图4是图3的A部放大图；
[0040] 图5是本发明所述微流体通道内一【具体实施方式】的结构示意图；
[0041] 图6是计算机模拟细胞通过微流体通道时与各表面接触几率示意图；
[0042] 图7是本发明所述循环肿瘤细胞检测过程一【具体实施方式】示意图。
[0043] 图中所示： W44] 1-盒体，2-微流控忍片，3-试剂瓶组，21-PDMS基片，22-载玻片，23-微通道， 24-交错式混合结构，25-微流体通道，26-捕获探针，41-循环肿瘤细胞，42-白细胞，43-细 胞识别探针，44-待检样本。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量 份数。 阳046] 实施例1
[0047]如图1所示，所述循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括盒体1、设置在盒体1内的微流 控忍片2和试剂瓶组3 ;所述试剂瓶组包括细胞识别探针、红细胞裂解液、清洗液、封闭液、 固定液、透膜液和固定细胞染色剂。 W48]如图2所示，所述微流控忍片2由PDMS基片21和载玻片22贴合构成，如图3所 示，所述PDMS基片21表面分布微通道23,所述微通道23为单通道，并且呈连续S型排布9 排，所述微通道23的底面具有周期性交错式混合结构24,如图4所示，所述交错式混合结构 24为鱼骨型结构。
[0049] 如图5所示，所述PDMS基片21与载玻片22键合后，所述微通道23与载玻片22 表面形成微流体通道25,所述微通道23的=个内表面均负载有捕获探针26,所述捕获探针 26为第一单链多核巧酸，所述鱼骨型交错式混合结构24中凹部宽度为125微米，凸部厚度 为75微米。鱼骨结构高度60微米，凸部W上微通道高度40微米。
[0050] 所述细胞识别探针为识别抗体/第二单链多核巧酸复合物，所述第二单链多核巧 酸可与第一单链多核巧酸特异性结合，所述识别抗体为anti-EpCAM、anti-EGFR、anti-HER2 和anti-MUC-1。
[0051] 所述第一单链多核巧酸和第二单链多核巧酸序列如表1，由生工生物提供。 阳0巧如图6所示，经过计算模拟，在细胞通过"鱼骨型"忍片微流体通道的时候，细胞与 载玻片表面（微流体通道下表面）接触的几率远低于微通道的表面（微流体通道上表面） 及"鱼骨型"结构的各个表面。图6中的每个点代表了细胞在流经忍片微通道是其中屯、与 相应的微通道表面距离小于细胞半径（假设为8微米）的位置，也就是细胞能够被忍片所 捕获的位置。因此将捕获探针设法负载于PDMS基片的微通道表面（包括了微流体通道上 表面和"鱼骨型"结构的各个表面）将有助于大大提高捕获效率。
[0053]表1第一单链多核巧酸和第二单链多核巧酸序列表
阳〇5引 实施例2
[0056] 与实施例1的区别在于，所述试剂瓶组包括细胞识别探针试剂瓶31、红细胞裂解 液试剂瓶32、清洗液试剂瓶33、封闭液试剂瓶34和不固定细胞染色剂瓶。
[0057] 另外，所述载玻片22为聚赖氨酸修饰的载玻片，来源于化ermo Scientific公司， 所述捕获探针26除了修饰微通道23表面，还修饰了载玻片22的表面。
[0058] 所述不固定细胞染色剂不固定细胞染色剂包括切3标记的第一单链多核巧酸和 APC标记的anti-CD45。依次选择CY5和TRITC的滤玻片在巧光显微镜下观察，切3标记的 第一单链多核巧酸显红色，APC标记的anti-CD45显绿色。
[0059] 实施例3所述微流控忍片的制备方法 W60] 实施例1和实施例2中所述微流控忍片2的制备方法如下：将PDMS基片21运用 等离子清洗机氧气处理15s后，在4%的3-氨丙基=乙氧基硅烷溶液中浸泡1小时使表面 产生氨基，再用超纯水清洗去除多余的试剂。
[0061] 氮气吹干后，将氨基修饰后的PDMS基片21贴合到洁净的载玻片22上，并置于 烘箱中8(TC处理2小时，待恢复至室溫后进行一步负载捕获抗探针26。具体方法为：将 500yL氨基修饰的第一单链多核巧酸与DMS0W体积比3:2混合，混合液再与BS3 (双班巧 酷亚胺辛二酸醋钢盐）水溶液W1:1体积比混合后通入忍片，室溫下解育1.化，然后依次用 0. 02%SDS溶液和超纯水清洗，并用氮气吹干后获得备用的微流控忍片2。
[0062] 实施例4用实施例1制备试剂盒检测循环肿瘤细胞
[0063] 如图7所示，循环肿瘤细胞检测过程如下：
[0064] (1)血液样本的预处理 W65] 将2毫升全血离屯、（200g，5min，4°C)，弃去上层的富血小板血浆，加入12血红细 胞裂解液，翻转仪上翻转lOmin，再次离屯、巧OOg，5min，4°C)，弃去上清，用清洗液皿SS清洗 剩余细胞，再次离屯、巧OOg，5min，4°C)，弃去上清，重悬于2毫升清洗液中，获得白细胞42 与循环肿瘤细胞41的细胞悬液。
[0066] 分别将2yL浓度为Img/血的细胞识别探针43 (识别抗体/第二单链多核巧酸复 合物），其中识别抗体为anti-化CAM、anti-EGFR、anti-肥R2和anti-MUC-