1，加入到2血细 胞悬液中，并置于翻转仪上解育40min，反应结束后向其中加入lOmL清洗液离屯、、清洗W除 去未被结合的细胞，然后用2mL清洗液重悬得到待检样本44。
[0067] (2)循环肿瘤细胞在通道中的捕获 W側运用恒流注射累将300yL的封闭液（lOwt%山羊血清与3wt%牛血清白蛋白混合 溶液）W300yL/h的流速向实施例1或2中的微流体通道25中灌注进行封闭，避免细胞 的非特异性吸附，再将2血上述处理后的待检样本44WImLA的流速通入微流体通道25， 在流动过程中微流体通道25表面（包括微通道23表面和载玻片22表面均负载了捕获探 针26)负载的捕获探针26动态捕获循环肿瘤细胞，结束后用清洗液皿SSW3mL/h的流速 清洗忍片10分钟W除去非特异性吸附的细胞。
[0069] (3)循环肿瘤细胞的染色
[0070] 将4wt%多聚甲醒水溶液的固定液W1血A的流速通入微流体通道25,与捕获到 的细胞动态解育15分钟，此时被捕获到忍片表面的循环肿瘤细胞的形态被固定。最后用 PBS缓冲液W2mL/h的流速清洗忍片10分钟W除去多余的固定液。
[0071] 通过恒流注射累W1血A的流速往微流体通道25中灌注0. %TritonX-100细 胞透膜液，W增加循环肿瘤细胞膜对染色剂的通透性，15分钟后，W300yL/h的流速灌注 300yL封闭液（lOwt%山羊血清与3wt%牛血清白蛋白混合溶液），对经固定透膜的细胞进 行封闭，减少染色剂的非特异性结合，降低巧光信号的背景噪声。
[0072]接下来将50yL的FITC标记的anti-CK和APC标记的anti-CD45按体积比1:1 配置的混合液WImLA的流速灌注到微流体通道25中，常溫解育2小时后，用PBS缓冲液 W2mL/h的流速清洗忍片10分钟，去除多余的染色试；WImL/h的流速将50yL20yg/mL 的核染色剂DAPI溶液通入微流体通道25中，用2mL/h的流速，再通入PBS缓冲液清洗通道 10分钟，完成循环肿瘤细胞的染色。
[0073] (4)循环肿瘤细胞的鉴定
[0074] 将步骤3)经染色处理的微流控忍片2在巧光显微镜下观察，依次选择CY5、門TC 和DAPI的滤玻片，观察通道表面巧光颜色，显蓝色则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则 CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据巧光显色，当DAPI+/CK+/ CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞，DAPI+/CK-/CD45+的为白细胞，DAPI-的 为无核红细胞或其他背景信号，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检测结果。 阳075] 实施例5用实施例2检测循环肿瘤细胞
[0076] 与实施例4的区别在于，第3步和第4步，具体如下：
[0077] (3)循环肿瘤细胞的染色
[0078] 将50yL的切3标记的第一单链多核巧酸和APC标记的anti-CD45的混合液W ImLA的流速灌注到微流体通道25中，参见图6,负载在细胞上的细胞识别探针43上仍有 很多第二单链多核巧酸未被结合，因此可与巧光标记的第一单链多核巧酸结合而实现对捕 获到的循环肿瘤细胞的染色，常溫解育1小时后，用清洗液皿SSW2mLA的流速清洗忍片 10分钟，去除多余的染色剂。
[0079] (4)循环肿瘤细胞的鉴定
[0080] 将步骤3)染色处理的微流控忍片2在巧光显微镜下观察，依次选择CY5和TR口C 的滤玻片，观察通道表面巧光颜色，巧光显红色则第二单链多核巧酸+，显绿色则CD45+，不 显绿色则CD45-，当第二单链多核巧酸+/CD45-且在明场下满足一定细胞形态学特征的为 循环肿瘤细胞，进行CTC检测后，可通过显微操作仪提取循环肿瘤细胞并进一步对其进行 基因测序。 阳0川实施例6对比实验
[0082] 对比例：与实施例2的区别在于，微流控忍片2中捕获探针按传统方法仅负载在载 玻片上。
[0083] 将600个结肠癌肿瘤细胞肥T116用染料VybrantDiULifeTehnologies)染色 后渗入6毫升健康人血液中混匀后平均分成6份，每份样本1毫升。血液样本分别用实施 例2、对比例的方法捕获肿瘤细胞，每个实验重复3次。捕获结束后直接用巧光显微镜计数 忍片中的肥T116细胞来计算捕获效率和实验偏差。
[0084] 结果表明：按照实施例2方法的捕获率为84, 7 + 3. 5%，高于按照对比例方法的捕 获率化2. 0 + 6. 6% )，且具有统计学意义（P<0. 01)。
【主权项】
1. 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，包括盒体、设置在盒体内的检测试剂和 微流控芯片，所述微流控芯片由PDMS基片和载玻片贴合构成，所述PDMS基片表面分布微通 道，所述微通道底面设有"鱼骨型"交错式混合结构；所述PDMS基片与载玻片键合后，微通 道与载玻片表面形成微流体通道，所述微通道表面负载有捕获探针。2. 根据权利要求1所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述载玻片为聚 赖氨酸修饰的载玻片。3. 根据权利要求1所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述鱼骨型交错 式混合结构中凹部宽度为125微米，凸部宽度为75微米，凸起高度60微米，所述凸部以上 微通道高度40微米。4. 根据权利要求1所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包 括细胞识别探针、红细胞裂解液、清洗液、封闭液和染色试剂。5. 根据权利要求4所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针为 第一单链多核苷酸，所述细胞识别探针为抗体/第二单链多核苷酸复合物，所述第二单链 多核苷酸是与第一单链多核苷酸特异性结合，所述识别抗体是与循环肿瘤细胞上具有识别 性的抗原相应的抗体。6. 根据权利要求5所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述识别抗体选 自 anti-EpCAM、anti-EGFR、anti-HER2 和 anti-MUC-1 中的一种以上。7. 根据权利要求4所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述染色试剂为 固定细胞染色试剂组和/或不固定细胞染色剂，所述固定细胞染色试剂组中包括固定细胞 染色剂、固定液和透膜液。8. 根据权利要求7所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述固定细胞染 色剂包括荧光素标记的anti-⑶45、荧光素标记的anti-CK和DAPI，并且上述三种染色剂的 荧光显色各不相同；所述不固定细胞染色剂包括荧光素标记的第一单链多核苷酸和荧光素 标记的anti-⑶45,并且上述二种染色剂的荧光显色不相同。9. 权利要求1-8任一所述循环肿瘤细胞检测试剂盒中微流控芯片的制备方法，其特征 在于，包括如下步骤：首先将PDMS基片浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中对微通道表 面进行氨基修饰，然后与载玻片进行键合，之后进一步进行微通道表面的捕获探针的负载。10. 权利要求1-7任一所述检测试剂盒在循环肿瘤细胞检测的应用，其特征在于，包括 如下步骤： 1) 血液样本前处理：肿瘤患者的血液样本经红细胞裂解液裂解，重悬于清洗液中以获 得包含白细胞与循环肿瘤细胞的细胞悬液，然后与细胞识别探针孵育，再通过离心除去多 余细胞识别探针，最后重悬于清洗液中以获得待检样本； 2) 循环肿瘤细胞捕获：将待检样本通入微流控芯片中，表面结合了细胞识别探针的细 胞与负载在微流体通道表面的捕获探针特异性结合，然后用清洗液清洗微流体通道以除去 非特异性吸附的细胞，从而完成对循环肿瘤细胞的捕获； 3) 循环肿瘤细胞染色：对捕获的循环肿瘤细胞在固定、透膜后进行CK、CD45和细胞核 染色或在细胞不固定的情况下对CD45和第二单链多核苷酸进行染色； 4) 循环肿瘤细胞计数：在显微镜下观察分析荧光图像，将CK+/CD45-/DAPI+的细胞或 CD45-/第二单链多核苷酸+的细胞鉴定循环肿瘤细胞并计数。
【专利摘要】本发明具体涉及一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用。包括盒体、设置在盒体内的检测试剂和微流控芯片，所述微流控芯片由PDMS基片和载玻片贴合构成，所述PDMS基片表面分布微通道，所述微通道底面设有“鱼骨型”交错式混合结构；所述PDMS基片与载玻片键合后，微通道与载玻片表面形成微流体通道，所述微通道表面负载有捕获探针。本发明还提供了所述微流控芯片的制备方法及使用试剂盒进行循环肿瘤细胞检测的方法。本发明与现有技术相比,在微通道的全部表面进行捕获探针的负载，增加了捕获效率；通过单链核苷酸修饰微流控芯片从而延长了芯片的保存时间；另外提供了不固定细胞的染色方法，为进一步细胞基因测序提供了方便。
【IPC分类】G01N33/574, G01N15/10
【公开号】CN105115878
【申请号】CN201510579359
【发明人】施奇惠, 邓宇亮, 汪民娇, 王智华
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月11日